09月01 【成功案例】百邁客云全面解析水稻抗旱分子機制
植物抗旱研究的老師看過來了，近期華中農(nóng)業(yè)大學水稻研究團隊成功構建水稻雙基因轉化抗旱株，并借助百邁客云計算平臺（30687.cn）挖掘該抗旱株轉錄組測序數(shù)據(jù)，完成對該新型水稻抗旱株抗旱機制初步探究。
中文題目：OsbZIP46、SAPK6基因共同過表達提升水稻抗旱能力
IF = 4.298 ? ? ? ? ? ? ? ? ?PMID:28694815
干旱是全世界范圍內(nèi)威脅水稻產(chǎn)量的主要非生物脅迫之一。作物的抗旱性狀一般認為由多基因控制，因此，抗旱相關多基因轉化策略理論上可以作為提高水稻抗旱性的一種有效手段。
脫落酸（abscisic acid,ABA）信號通路在植物非生物脅迫響應網(wǎng)絡中處于中心位置，該通路包含4個主要組件：a）ABA 受體PYR/PYL/PCAR，b）A型蛋白磷酸酶2C，c）蛋白激酶SnPK2，d）bZIP轉錄因子家族（第3亞家族）。之前研究表明，bZIP轉錄因子活性在多種植物中可被蛋白磷酸酶SnPK2s通過磷酸化調(diào)節(jié)。我們之前的研究也表明，bZIP轉錄因子OsbZIP23和OsbZIP46在水稻抗旱過程中扮演著重要角色，且其轉錄調(diào)控活性可被SnPKs家族SAPK2與SAPK6激活。因此，bZIP轉錄因子家族與SAPKS蛋白磷酸酶家族可作為多基因轉化策略中的候選基因來提升水稻抗旱能力。
技術路線
材料
轉化基因：OsbZIP46CA1（bZIP轉錄因子OsbZIP46刪除負調(diào)控domainD）+ SAPK6（蛋白磷酸酶家族）；
轉化載體：pCB2004質(zhì)粒
水稻轉化受體材料 ： 東北種植品質(zhì)KY131
水稻轉基因材料：XL22（OsbZIP46CA1+SAPK6），CA1-OE（OsbZIP46CA1），SAPK6-OE（SAPK6）
RNA-seq材料：XL22、CA1-OE、SAPK6-OE、KY-131-N4葉齡種子材料，每個處理3個生物學重復
方法
轉化：農(nóng)桿菌介導轉化
插入片段拷貝數(shù)檢測：Southern Blot
插入基因轉錄水平評估：熒光定量PCR
插入基因蛋白表達及活性評估：熒光定量PCR檢測OsbZIP46CA1調(diào)控基因Rab21、 Rab16B在轉基因材料中的轉錄水平；轉基因材料對ABA敏感性判斷轉化基因是否正常過蛋白過表達且產(chǎn)生活性
抗旱性評估： 種子發(fā)育期，缺水處理7天，恢復給水7天后存活率；生殖生長期，孕穗期缺水處理14天，產(chǎn)量、灌漿速率、穗數(shù)、小穗花數(shù)等指標
RNA-seq測序：Hiseq測序平臺，百邁客云（30687.cn）數(shù)據(jù)分析平臺
1、轉化株構建與篩選
1）使用MISSA系統(tǒng)構建pCB2004+OsbZIP46CA1+SAPK6重組質(zhì)粒，采用農(nóng)桿菌介導轉化方法將兩個抗旱相關目標基因插入東北栽培品種水稻KY131基因中，構建OsbZIP46CA1、APK6雙基因轉化株。另外，也使用同樣的轉化體系分別構建了上述兩個基因的單基因轉化株。
2）通過southern-blot雜交技術，鑒定T0初始轉化株中插入基因的拷貝數(shù)，挑選插入基因單拷貝的T0的T1子代初步鑒定具備抗旱性狀的轉基因株（肉眼觀察）。
3）最終篩選得到一個在生殖器官發(fā)育階段抗旱強于非轉基因株的雙基因轉化株XL22，見圖1B。
4）利用熒光定量PCR技術，檢查了XL22轉基因株及其對應的單基因轉化株中的插入基因是否過表達，如圖1C所示，上述轉化株中插入基因均出現(xiàn)了預期的轉錄水平。
5）以OsbZIP46CA1的下游調(diào)控基因Rab21、Rab16B的轉錄水平，轉化株對ABA的敏感性來判斷插入基因是否發(fā)揮作用，如圖1C所示，轉化株中點的Rab21、 Rab16B轉錄水平均出現(xiàn)上調(diào)，且轉化株對ABA更加敏感，說明上述轉化株中的插入基因均能正常發(fā)揮作用。
2、XL22轉化株抗旱能力評估
a）生殖生長期抗旱能力評估：XL22、CA1-OE（OsbZIP46CA1轉化株）、SAPK6-OE（SAPK6轉化株）、KY-131-N（非轉基因株）4組材料，每組4個獨立生物學重復，孕穗期缺水處理14天，比較不同材料之間的單株產(chǎn)量、灌漿速率、穗數(shù)、小穗花數(shù)、圓錐花序數(shù)、單位面積產(chǎn)量6個指標。如圖3所示，無論是肉眼觀察（3A、3B）結果，還是上述6個指標（3C）統(tǒng)計結果，都表明XL22在抗旱性上要優(yōu)于單基因轉化株與非轉基因株。
b）種子發(fā)育期抗旱能力評估：XL22、CA1-OE（OsbZIP46CA1轉化株）、SAPK6-OE（SAPK6轉化株）3組材料（4葉齡），每組3個生物學重復，7天缺水處理，觀察恢復給水7天后的葉片卷曲情況，統(tǒng)計存活率。如圖4A所所示，恢復給水7天后，XL22相較于單基因轉化株，葉卷曲更加輕微，如圖B所示，XL22的存活率也要顯著高于單基因轉化株。另外，如圖4所示，XL22離體葉片子在室內(nèi)環(huán)境下，脫水速度也顯著低于其他材料。該結果表明，XL22在種子發(fā)育階段的抗旱能力也要強于單基因轉化株。
3、XL22轉化株耐熱、抗寒能力評估
分別取XL22、CA1-OE、SAPK6-OE、KY-131-N的4葉齡種子材料，每個3個生物學重復，均進行42℃ 12小時，4℃5天處理，最后正常環(huán)境下生長7天，觀察這各材料之間的葉卷曲清苦以及存活率，結果顯示，XL22表現(xiàn)為個更高的存活率（圖5C)，更加輕微的葉片卷曲（圖4A），表明XL22相較于單基因轉化株與非轉基因株擁有更強的耐熱、抗寒能力。
4、RNA-seq揭示XL22抗旱分子學機制
a）為了分析XL22抗旱表型后的基因調(diào)控網(wǎng)絡，研究者分別對XL22、 CA1-OE、SAPK6-OE 3個轉化株系在正常給水與相同缺水處理條件下的材料進行了轉錄組測序，取樣部位為倒二葉，每個處理設置兩個生物重復，測序使用illumina Hiseq平臺，PE150讀取方式，數(shù)據(jù)分析在百邁客云計算平臺（30687.cn）完成。
b）分析結果顯示，XL22的缺水處理相較于正常給水組材料，2977個基因轉錄水平顯著上調(diào)，3243個顯著下調(diào)；CA1-OE中，2962個基因轉錄上調(diào)， 3514個基因轉錄下調(diào)；SAPK6-OE中，3433個基因轉錄上調(diào)，3472個基因轉錄下調(diào)（FDR < 0.01, |FC| > 2）。大部分的轉錄上調(diào)基因在3個材料之間是共有的，如圖6B所示，表明這些上調(diào)基因在水稻干旱脅迫響應中功能比較保守。
c）由于轉基因材料中過表達基因為bZIP家族轉錄因子及其活性激活基因家族，研究者重點關注了3個材料中轉錄上調(diào)的基因，這些基因被劃分為4類：Group1，XL22相較于CA1-OE特有上調(diào)基因，645個；Group2,XL22相較于SAPK6-OE特有上調(diào)基因，500個基因特異上調(diào)；Group3，CA1-OE相較于SAPK6-OE特有上調(diào)基因，398個；Group4，SAPK6-OE相較于CA1-OE特有上調(diào)基因，869個。Group I主要分布在“Response to ABA”、“Regulation of Plant-type Hypersensitive response”等GO term；Group II主要分布在“Organic Substance Biosynthetic Process” 、“Salicylic Acid Biosynthetic Process” 、“Regulation of Hydrogen Peroxide Metabolic Process”等GO term；Group3主要分布在“Gene Expression and Regulation”、 “Nitrate Related Metabolic Process” 、 “Carbohydrate Biosynthetic Process” 等GO term；Group4主要分布在 “Cytokinesis and Cell Proliferation”、“Microtubule Related Process”、“Response to Abiotic Stress” 等GOterm（見圖6C）。因此推測，XL22中的兩個基因可能激活了不同的干旱脅迫應答基因。
d）為了揭示GroupI 、Group2兩個基因集內(nèi)部的基因調(diào)控關系，研究者基于STRING數(shù)據(jù)庫分別繪制了上述兩個基因集內(nèi)部基因的蛋白互作網(wǎng)絡圖。如圖7所示，GroupI蛋白互作網(wǎng)絡中包含481個PPI（protein-protein intereaction，PPI），Group2中包含280個PPI。其中，有6個基因在蛋白互作網(wǎng)絡中均處于非常中心的位置（與之互作蛋白數(shù)量越多，越靠近中心位置）。其中，3個（LOC_Os12g13720, ?LOC_Os03g58800, ?LOC_Os09g31486) 在兩個蛋白互作網(wǎng)絡中均處于中心位置，分別編碼 PDR ABC transporter, a ATPase, and a DnaK/Hsp70s family protein,可能在干旱應答過調(diào)控網(wǎng)絡發(fā)揮著非常關鍵的；其他3個基因（Group1特異：LOC_Os04g42260 ?LOC_Os02g38580，Group2特異：LOC_Os05g03050）分別編碼protein phosphatase、Rad51、Hsp90 ，從功能可以看出，它們與水稻干旱應答同樣相關。
- 構建了抗旱OsbZIP46CA1+SAPK6雙基因轉化水稻XL22。
- 揭示了XL22抗旱表型后部分分子調(diào)控機制，為之后進一步的分析調(diào)控機制研究提供參考信息。
研究中涉及到的轉錄組數(shù)據(jù)分析，從下機數(shù)據(jù)質(zhì)控、與參考基因組比對，到基因轉錄水平定量、差異表達分析，到最后共表達分析、蛋白互作分析，均是該實驗室的同學們在百邁客云平臺的有參轉錄組APP提供的圖形化界面下自主完成的，該步操作無需編程語言基礎，無需linux系統(tǒng)命令行界面下軟件安裝、調(diào)試與運行經(jīng)驗，更重好的是無需等待，基礎分析7天完成，個性化分析幾分鐘人機交互完成1次，你要做的只是網(wǎng)頁下簡單幾步便可完成數(shù)據(jù)導入、參數(shù)設定、任務運行、結果查看、數(shù)據(jù)后期挖掘等數(shù)據(jù)分析步驟。