动漫精品中文无码卡通动漫,91精品人人做人碰人人爽,少妇A片风狂少妇AA片 http://30687.cn BMKCloud_生物云計(jì)算平臺(tái) Tue, 19 Nov 2024 03:10:06 +0000 zh-CN hourly 1 https://wordpress.org/?v=4.7.10 http://30687.cn/wp-content/uploads/2019/01/cropped-512512-32x32.jpg 百邁客云 http://30687.cn 32 32 百邁客項(xiàng)目結(jié)題報(bào)告講解開直播啦! http://30687.cn/archives/6093 Thu, 15 Jul 2021 07:32:10 +0000 http://30687.cn/?p=6093 為了讓大家快速全面掌握百邁客云APP使用,準(zhǔn)確、有效地解讀自己的項(xiàng)目分析結(jié)果,7月下旬開始,我們推出了每周二13:30-15:00的線上【結(jié)果文件講解+數(shù)據(jù)挖掘】直播課,歡迎老師們參與,直播的最后我們有設(shè)置互動(dòng)抽獎(jiǎng)環(huán)節(jié),期待老師們的加入!

直播內(nèi)容安排

 

主題? 直播內(nèi)容? 日期? 會(huì)議鏈接?
轉(zhuǎn)錄組班? 有參轉(zhuǎn)錄組結(jié)題報(bào)告講解及常見數(shù)據(jù)挖掘? 7.20(周二)?
轉(zhuǎn)錄組班? 無(wú)參轉(zhuǎn)錄組結(jié)題報(bào)告講解及常見數(shù)據(jù)挖掘? 7.27(周二)?
微生物班? 微生物多樣性結(jié)題報(bào)告講解及常見數(shù)據(jù)挖掘? 8.3(周二)?
微生物班? 微生物多樣性APP操作及常見問(wèn)題解答? 8.10(周二)? ?

更多課程上新中,敬請(qǐng)期待?。?!

小福利~

每場(chǎng)直播中或直播后會(huì)抽取3名幸運(yùn)聽眾好禮相送,以下獎(jiǎng)品任選一項(xiàng),即時(shí)生效:

  • 轉(zhuǎn)錄組任意一款A(yù)PP次賬號(hào)
  • 微生物多樣性APP次賬號(hào)
  • 百邁客1W云豆

每周二下午13:30與您相約百邁客云,助您數(shù)據(jù)挖掘!

本活動(dòng)解釋權(quán)歸百邁客生物科技有限公司所有

]]>
百邁客祝您開工大吉!拼手氣,抽大獎(jiǎng)!【千元課程、65萬(wàn)抵用券免費(fèi)領(lǐng)】 http://30687.cn/archives/5997 Fri, 19 Feb 2021 02:55:37 +0000 http://30687.cn/?p=5997 新年伊始,牛運(yùn)亨通,百邁客祝您開工大吉!

 

新的一年,百邁客生物為了讓生物科研者更好的解讀基因、助力科研,在新春到來(lái)之際特舉行“恭賀新春、幸運(yùn)抽獎(jiǎng)”活動(dòng)。

活動(dòng)詳情如下:

活動(dòng)時(shí)間

即日起至2021年2月28日

活動(dòng)獎(jiǎng)品

一等獎(jiǎng):3000元項(xiàng)目代金券——100名

二等獎(jiǎng):1000元項(xiàng)目代金券——200名

三等獎(jiǎng):500元項(xiàng)目代金券——300名

四等獎(jiǎng):精美紀(jì)念禮品一份——400名

參與方式

微信掃一掃參與抽獎(jiǎng)

轉(zhuǎn)發(fā)有禮

進(jìn)入上方活動(dòng)頁(yè)面,獲取個(gè)人專屬海報(bào)后,分享給5個(gè)好友參與抽獎(jiǎng)活動(dòng),即可獲贈(zèng)百邁客云課堂無(wú)門檻1000元培訓(xùn)課程抵用券,免費(fèi)在線學(xué)習(xí)300+培訓(xùn)課程。

部分課程:

查看更多課程>>

活動(dòng)規(guī)則

1、每個(gè)用戶限1次抽獎(jiǎng)機(jī)會(huì)。

2、代金券滿3萬(wàn)可用,不與其他優(yōu)惠活動(dòng)同享,有效期至3月31日,中獎(jiǎng)后代金券會(huì)自動(dòng)存入微信“我—卡包—券和禮品卡”中,請(qǐng)您在有效期內(nèi)聯(lián)系我們及時(shí)使用,所有代金券不得兌換現(xiàn)金,不設(shè)找零,僅可抵用一次。

3、紀(jì)念品將在活動(dòng)結(jié)束后工作人員將與您取得聯(lián)系,溝通派送事宜。

本活動(dòng)最終解釋權(quán)歸北京百邁客生物科技有限公司所有

]]>
百邁客云課堂會(huì)員升級(jí)! http://30687.cn/archives/5909 Fri, 05 Feb 2021 08:29:19 +0000 http://30687.cn/?p=5909 會(huì)員卡1:任選4個(gè)生信課程,5000元/年/人

會(huì)員卡2:任選6個(gè)生信課程,7000元/年/人

會(huì)員卡3:任選10個(gè)生信課程,10000元/年/人

會(huì)員卡4:任選13個(gè)生信課程,12000元/年/人

會(huì)員權(quán)益

1、免費(fèi)視頻包:百邁客云課堂現(xiàn)有價(jià)值近6千的收費(fèi)課程免費(fèi)看(除以上生信課程外)

2、免費(fèi)直播課程:所選課程對(duì)應(yīng)1年的直播觀看權(quán)限,觀看直播不限次。

3、免費(fèi)線下活動(dòng):免費(fèi)參加線下會(huì)員活動(dòng)機(jī)會(huì),會(huì)員活動(dòng)每年至少一次,活動(dòng)不僅有專家、有美食、有美酒同時(shí)還有美景與技術(shù)牛

4、會(huì)員卡3、4另贈(zèng)送百邁客第八屆全國(guó)功能基因組學(xué)峰會(huì)門票(峰會(huì)為>500人會(huì)議,現(xiàn)已舉辦7屆,每屆均有院士大牛參加,收獲絕對(duì)多)

5、收費(fèi)工具免費(fèi)用:生信課程中同樣分析可選擇代碼或在線工具實(shí)現(xiàn),其中收費(fèi)在線工具可有3個(gè)月免費(fèi)使用權(quán)

6、購(gòu)課折扣(超過(guò)會(huì)員卡內(nèi)的課程,每增加一個(gè)可享7折優(yōu)惠)

7、所有會(huì)員卡需在購(gòu)買后1月內(nèi)選擇課程。

會(huì)員卡1、2所選的課程需在3個(gè)月內(nèi)兌換開通;

會(huì)員卡3、4所選課程在購(gòu)買后6個(gè)月內(nèi)兌換開通。

注:1、所有課程有效期從開通之時(shí)開始計(jì)算。2、所選課程有未上線的,可在上線后2個(gè)月內(nèi)選擇開通。若上線課程在兌換開通時(shí)間內(nèi),則此條無(wú)效。

8、課程視頻有效期一年

9、所有套餐僅限購(gòu)買本人參加

注:表中直播時(shí)間為已確定的直播月份,后期會(huì)根據(jù)實(shí)際情況再次追加直播場(chǎng)次。

購(gòu)買以上任意一個(gè)生信課程,均可享受課程一年視頻觀看及參加一次課程直播權(quán)限。購(gòu)買百邁客試劑盒滿5000元,可贈(zèng)送生信單課程一個(gè)


套餐選課推薦

1、生信入門基礎(chǔ)課:零基礎(chǔ)R語(yǔ)言繪圖+生信入門課程(可組合:轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘+代謝蛋白生信課程)
2、基因組類課程:比較基因組學(xué)+基因家族分析課程(可組合:零基礎(chǔ)R語(yǔ)言繪圖+生信入門+GWAS+遺傳進(jìn)化+重測(cè)序分析課程)
3、群體類課程:GWAS+遺傳進(jìn)化課程+重測(cè)序分析課程(可組合:零基礎(chǔ)R語(yǔ)言繪圖+生信入門+比較基因組+基因家族分析課程)
4、轉(zhuǎn)錄調(diào)控類課程:轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘+代謝蛋白組學(xué)+ATAC分析課程(可組合:零基礎(chǔ)R語(yǔ)言繪圖+生信入門)
5、微生物多樣性課程:微生物多樣性生信分析課程+微生物數(shù)據(jù)挖掘課程(可組合:零基礎(chǔ)R語(yǔ)言繪圖+生信入門)

具體課程介紹

一、零基礎(chǔ)R語(yǔ)言繪圖課程

本課程主要是用R代碼來(lái)介紹方法的實(shí)現(xiàn),實(shí)操性強(qiáng)。同時(shí),本次課程會(huì)系統(tǒng)性對(duì)R語(yǔ)言基礎(chǔ)進(jìn)行講解,讓大家對(duì)R語(yǔ)言形成一個(gè)整體的思路?,F(xiàn)在開源的R代碼很多,了解了基礎(chǔ)構(gòu)建,后面拿到開源的代碼后就可以自己知道怎么修改,這些參數(shù)是什么了。對(duì)于后期R語(yǔ)言的自學(xué)是一個(gè)很好的敲門磚。

二、生信入門基礎(chǔ)課程

本課程主要針對(duì)沒有接觸過(guò)生信,而且沒有具體學(xué)習(xí)的生信方向,想了解入門生信的同學(xué)們。本課程涉及生信入門基礎(chǔ)的了解知識(shí)、常用的在線工具、以及涉及的幾種語(yǔ)言基礎(chǔ)介紹,讓你了解生信大概內(nèi)容,從而根據(jù)這些內(nèi)容了解自己想學(xué)習(xí)的方向,進(jìn)而一步步細(xì)化去學(xué)習(xí)研究。

三、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘生信課程

本課程主要針對(duì)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果數(shù)據(jù)的挖掘分析,將從常用的轉(zhuǎn)錄組生信分析基礎(chǔ)入手,帶領(lǐng)大家學(xué)習(xí)轉(zhuǎn)錄組分析中常用的分析方案、個(gè)性化分析軟件及其實(shí)現(xiàn)方法,其中包含熱點(diǎn)的WGCNA分析,熱圖繪制,差異基因分類分析等繪圖分析。滿足轉(zhuǎn)錄組文章常見分析展示需求。

四、代謝與蛋白組學(xué)生信課程

本課程主要針對(duì)代謝和蛋白組學(xué)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘分析,從代謝和蛋白組學(xué)結(jié)果文件入手,手把手教授個(gè)性化繪圖及分析技巧。

五、比較基因組生信分析課程

本課程主要從基礎(chǔ)生信操作開始,從已發(fā)表的NG、NC等高水平文章入手,帶領(lǐng)大家學(xué)習(xí)并實(shí)際操作高分文章中圖形及分析是如何實(shí)現(xiàn)的,學(xué)習(xí)比較基因組學(xué)常用的分析方法,從而滿足文章后期發(fā)表的需求。

六、基因家族生信分析課程

近年來(lái)基因家族的生物信息學(xué)分析已經(jīng)成為大家研究的熱點(diǎn),目前已經(jīng)表明許多重要的基因,如一些轉(zhuǎn)錄因子,都是以基因家族的形式存在。本課程系統(tǒng)的對(duì)基因家族進(jìn)行了生物信息分析,讓大家更加深入學(xué)習(xí)了解基因家族分析研究,從而進(jìn)一步豐富我們研究的內(nèi)容,提升文章檔次,實(shí)現(xiàn)科研成果的快速產(chǎn)出。

七、GWAS生信分析課程

本課程主要從實(shí)踐入手,重點(diǎn)講解 GWAS 分析中用到的各種分析方法與常用分析軟件。包括群體結(jié)構(gòu)分析、主成分分析、親緣關(guān)系分析、連鎖不平衡分析、單體型分析等內(nèi)容。從原始數(shù)據(jù)開始,逐步完成分析內(nèi)容,并對(duì)分析內(nèi)容進(jìn)行整理與挖掘,將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成更直觀的圖形來(lái)展示最終的分析結(jié)果。若您想做、準(zhǔn)備做或正在做GWAS相關(guān)的項(xiàng)目,那這個(gè)課程就很適合您,即可學(xué)會(huì)自己分析,同時(shí)了解分析過(guò)程中的參數(shù)設(shè)置,可以很好協(xié)助您的論文寫作。

八、微生物多樣性生信分析課程

本課程將微生物多樣性生信分析中的每一個(gè)步驟以及每一步驟所涉及的參數(shù)都很明確的列了出來(lái),詳細(xì)為大家進(jìn)行講解及實(shí)操演示,幫助大家更好的了解學(xué)習(xí)微生物多樣性分析的整個(gè)過(guò)程。

九、微生物多樣性數(shù)據(jù)挖掘分析課程

本次課程主要針對(duì)微生物多樣性數(shù)據(jù)的后期挖掘繪圖,主要利用R語(yǔ)言來(lái)進(jìn)行微生物多樣性相關(guān)圖形的繪制,從而實(shí)現(xiàn)自己可以分析繪制圖形,更重要的是自己可以根據(jù)不同雜志的要求,很快得出對(duì)應(yīng)的圖形。

十、重測(cè)序生信分析課程

本課程主要針對(duì)基于二代及三代測(cè)序的重測(cè)序分析。以實(shí)際操作為主,從序列比對(duì)開始到突變位點(diǎn)的分析及應(yīng)用。包括常用的分析方法及工具軟件(BWA、GATK、Plink等)。讓大家能夠快速上手有關(guān)重測(cè)序的相關(guān)分析并為后續(xù)與突變相關(guān)的高級(jí)分析打下良好的基礎(chǔ)。

十一、遺傳進(jìn)化生信分析課程

本次課程主要講解群體遺傳進(jìn)化分析中常見分析內(nèi)容以及定制化繪制相關(guān)圖形,同時(shí)涵蓋高級(jí)分析,基因流、分化時(shí)間、群體歷史動(dòng)態(tài)三塊高級(jí)分析內(nèi)容。本課程主要面向初中級(jí),且對(duì)遺傳進(jìn)化分析有需求的老師。

十二、ATAC生信分析課程

本課程主要從技術(shù)原理、實(shí)驗(yàn)步驟、生物信息學(xué)分析、文獻(xiàn)分享四大內(nèi)容向大家介紹ATAC-Seq技術(shù)。同時(shí),本課程還涉及專門的生物信息學(xué)實(shí)操課程,帶領(lǐng)大家學(xué)習(xí)ATAC-Seq基本分析流程,其中包括數(shù)據(jù)質(zhì)控、Peak Calling、Motif分析等。從而幫助大家將ATAC-Seq運(yùn)用在自己的課題當(dāng)中。

]]>
微生物分析平臺(tái)個(gè)性化分析更新 http://30687.cn/archives/5821 Wed, 13 Jan 2021 08:48:08 +0000 http://30687.cn/?p=5821 功能預(yù)測(cè)分析

 

基于樣品中的物種組成及豐度信息推測(cè)樣品中表型類型和功能組成及差異。包含PICRUSt2功能預(yù)測(cè)、FAPROTAX功能預(yù)測(cè)、BugBase表型預(yù)測(cè)、Tax4Fun2功能預(yù)測(cè)和真菌FunGuild表型預(yù)測(cè)。

一. PICRUSt2功能預(yù)測(cè)

PICRUSt1軟件依賴于Greengene數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種比對(duì)、功能數(shù)據(jù)輸出。而Greengene數(shù)據(jù)庫(kù)在2013年之后就停止了更新,距今為止已有7年。隨著時(shí)間的推移,大量微生物基因組數(shù)據(jù)測(cè)序獲得,而停止更新的Greengene數(shù)據(jù)庫(kù)限制了PICRUSt的功能預(yù)測(cè)范圍。對(duì)于近年來(lái)測(cè)序獲得微生物功能功能信息無(wú)法進(jìn)行預(yù)測(cè),滿足不了當(dāng)前的研究需求,為了補(bǔ)上這塊滿足科研工作者的需求,PICRUSt團(tuán)隊(duì)于近期升級(jí)了軟件,正式公布了PICRUSt2。

1)將待預(yù)測(cè)的OTU代表序列置于軟件中已有的系統(tǒng)發(fā)育樹中,而不是直接對(duì)OTU序列進(jìn)行分類學(xué)注釋;

2)不再基于GreenGene 16S數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能預(yù)測(cè),其用于預(yù)測(cè)的參考基因組數(shù)據(jù)庫(kù)相比先前也已擴(kuò)大了10倍以上

參考文獻(xiàn):Douglas G M, Maffei V J, Zaneveld J, et al. PICRUSt2: An improved and extensible approach for metagenome inference. bioRxiv, 2019.

功能組成分析:統(tǒng)計(jì)各樣品在不同分類層級(jí)上的功能組成。

注:橫坐標(biāo)為樣品名稱;縱坐標(biāo)為功能相對(duì)豐度百分比。

功能差異分析:統(tǒng)計(jì)各樣品或者各組在不同分類層級(jí)上的功能差異。

注:圖中不同顏色代表不同的樣品或分組。左圖所示為不同功能在兩個(gè)樣品或者兩組樣品中的豐度比例,中間所示為95%置信度區(qū)間內(nèi)功能豐度的差異比例,最右邊的值為校正后p值。

 

二. FAPROTAX功能預(yù)測(cè)

FAPROTAX較適用于對(duì)環(huán)境樣本的生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程(特別是碳、氫、氮、磷、硫等元素循環(huán))進(jìn)行功能注釋預(yù)測(cè)。FAPROTAX是根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)手動(dòng)構(gòu)建的數(shù)據(jù)庫(kù),它把原核微生物的分類和代謝等功能對(duì)應(yīng)起來(lái),目前收集自4600多個(gè)原核微生物的80多個(gè)功能分組7600多條功能注釋信息。

參考文獻(xiàn):Louca S, Parfrey L W, Doebeli M. Decoupling function and taxonomy in the global ocean microbiome[J]. Science, 2016, 353(6305): 1272-1277.

三. BugBase表型預(yù)測(cè)

BugBase是一種預(yù)測(cè)復(fù)雜微生物組內(nèi)功能途徑的生物水平覆蓋以及生物可解釋表型的方法。BugBase首先通過(guò)預(yù)測(cè)的16S拷貝數(shù)對(duì)OTU進(jìn)行歸一化,然后使用提供的預(yù)先計(jì)算的文件預(yù)測(cè)微生物表型。包括以下七方面:革蘭氏陽(yáng)性 (Gram Positive)、革蘭氏陰性 (Gram Negative)、生物膜形成 (Biofilm Forming)、致病潛力 (Pathogenic Potential)、移動(dòng)元件含量 (Mobile Element Containing)、氧的利用 (Oxygen Utilizing)、氧化脅迫耐受 (Oxidative Stress Tolerant)。

參考文獻(xiàn):Ward T, Larson J, Meulemans J, Hillmann B, Lynch J, SidiropoulosD,Spear J, Caporaso G, Blekhman R, Knight R, Fink R, Knights D. 2017.BugBase predicts organism level microbiome phenotypes. bioRxiv.

四. Tax4Fun2功能預(yù)測(cè)

Tax4Fun全面升級(jí)為Tax4Fun2.評(píng)估微生物群落的功能和冗余度是環(huán)境微生物學(xué)的主要挑戰(zhàn)。Tax4Fun2可基于16S rRNA基因序列快速預(yù)測(cè)原核生物的功能譜和功能冗余。通過(guò)合并用戶定義的、特定于棲息地的基因組信息,可以顯著提高預(yù)測(cè)功能圖譜的準(zhǔn)確性。

優(yōu)點(diǎn):

(1)不再局限于僅SILVA的特定版本注釋的OTU豐度表,允許直接以O(shè)TU代表序列作為輸入,通過(guò)與指定參考數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)實(shí)現(xiàn)物種注釋。除了Tax4Fun2提供的已構(gòu)建好的參考集(相比之前大幅擴(kuò)大),也允許我們提供自定義的參考集,使用非常靈活。

(2)側(cè)重于原核數(shù)據(jù),但也可以合并真核數(shù)據(jù)。

(3)提供了計(jì)算特定功能冗余的方法,對(duì)于預(yù)測(cè)特定功能在環(huán)境擾動(dòng)期間丟失的可能性至關(guān)重要。

(4)精度和穩(wěn)定性顯著提升。

參考文獻(xiàn):Wemheuer F, Taylor J A, Daniel R, et al. Tax4Fun2: a R-based tool for the rapid prediction of habitat-specific functional profiles and functional redundancy based on 16S rRNA gene marker gene sequences. bioRxiv, 2018.

五. FunGuild表型預(yù)測(cè)

FUNGuild(Fungi Functional Guild)是一種可用于由生態(tài)協(xié)會(huì)分類學(xué)解析真菌的工具,用簡(jiǎn)單而一致的方法將大型序列庫(kù)分類為具有生態(tài)意義的類別。根據(jù)營(yíng)養(yǎng)方式將真菌分為12類,然后構(gòu)建了一個(gè)真菌分類和功能分組(guild)之間的數(shù)據(jù)庫(kù),通過(guò)這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)你就可以對(duì)真菌進(jìn)行功能分類。

病理營(yíng)養(yǎng)型(pathotroph):通過(guò)損害宿主細(xì)胞而獲取營(yíng)養(yǎng)(包括吞噬型真菌phagotrophs)。

共生營(yíng)養(yǎng)型(symbiotroph):通過(guò)與宿主細(xì)胞交換資源來(lái)獲取營(yíng)養(yǎng)。

腐生營(yíng)養(yǎng)型(saprotroph):通過(guò)降解死亡的宿主細(xì)胞來(lái)獲取營(yíng)養(yǎng)。包括動(dòng)物病原菌(animal pathogens)、叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi)、外生菌根真菌(ectomycorrhizal fungi)、杜鵑花類菌根真菌(ericoid mycorrhizal fungi)、葉內(nèi)生真菌(foliar endophytes)、地衣寄生真菌(lichenicolous fungi)、地衣共生真菌(lichenized fungi)、菌寄生真菌(mycoparasites)、植物病原菌(plantpathogens)、未定義根內(nèi)生真菌(undefined root endophytes)、未定義腐生真菌(undefined saprotrophs)和木質(zhì)腐生真菌(wood saprotrophs)。

參考文獻(xiàn):Nguyen NH, Song Z, Bates ST, Branco, S, Tedersoo L, Menke J, Schilling JS, Kennedy PG. 2016. FUNGuild: an open annotation tool for parsing fungal community datasets by ecological guild. Fungal Ecology 20:241-248.

 

MicroPITA分析

 

在做完16S、18S或ITS等微生物多樣性研究后,我們常常還會(huì)想進(jìn)一步了解微生物群落的功能。通常情況下,會(huì)采用宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組或宏代謝組等方法深入分析,但相對(duì)于擴(kuò)增子測(cè)序,宏基因組等測(cè)序手段的價(jià)格還是相對(duì)較高,因此需要從已測(cè)完的樣本中再挑選合適的樣本進(jìn)行宏基因組測(cè)序。可利用microPITA進(jìn)行樣品預(yù)測(cè),挑選出合適的樣品。該分析是基于大量微生物多樣性的數(shù)據(jù),根據(jù)不同指標(biāo)篩選出代表性樣本,以便于開展開展后續(xù)研究。

類型 方法 含義 樣本特點(diǎn)
無(wú)監(jiān)督方法 diverse 選擇α多樣性最高的樣本 生態(tài)多樣性高
features 根據(jù)目標(biāo)物種挑選樣本 針對(duì)特定物種
extreme 選擇β多樣性距離最遠(yuǎn)的樣本 極端樣本
representative 最能反映整體距離差異的樣本 核心樣本
有監(jiān)督方法 Distinct 根據(jù)表型/分組特征,挑選組間β多樣性距離最大的樣本 依據(jù)表型/分組特征,選擇極端樣本
Discriminant 根據(jù)表型/分組特征,挑選離分組中心最近的樣本 依據(jù)表型/分組特征,挑選核心樣本

參考文獻(xiàn):Tickle TL, Segata N, Waldron L, Weingart U, Huttenhower C. Two-stage microbial community experimental design. ISME J. 2013 Dec;7(12):2330-9. doi: 10.1038/ismej.2013.139. Epub 2013 Aug 15. PMID: 23949665; PMCID: PMC3834858.

群落結(jié)構(gòu)分析

 

微生物群落生態(tài)學(xué)的一個(gè)主要目標(biāo)是了解構(gòu)成跨時(shí)空物種豐度模式的過(guò)程。確定性和隨機(jī)性兩種類型的過(guò)程會(huì)影響群落的聚集。確定性過(guò)程與生態(tài)選擇相關(guān),隨機(jī)過(guò)程包括不可預(yù)測(cè)的擾動(dòng)、概率性的散布和隨機(jī)的出生-死亡事件等,這些變化不是由環(huán)境決定的適應(yīng)性結(jié)果。通過(guò)零模型量化群落的絕對(duì)系統(tǒng)發(fā)育距離與隨機(jī)系統(tǒng)發(fā)育距離的偏離度,偏離程度越大,群落受確定性因素的影響越大,偏離度越小,群落受隨機(jī)性因素的影響越大。通常使用βNTI(最近種間親緣關(guān)系指數(shù))以評(píng)估不同時(shí)空尺度下隨機(jī)性和確定性過(guò)程對(duì)微生物群落組裝的影響。

其中,| βNTI |>2表示觀察到的兩個(gè)群落之間的更替主要由選擇控制,其中βNTI>+2與變量選擇一致,而βNTI<-2表示同質(zhì)選擇。因此,| βNTI |<2意味著一組群落的更替受擴(kuò)散限制、均勻化擴(kuò)散或未消除過(guò)程的控制。為了理清這些過(guò)程,Raup-Crick矩陣(RCbray)基于群落的標(biāo)準(zhǔn)Bray-Curtis矩陣構(gòu)建,提供有關(guān)所觀察到的流動(dòng)程度是否明顯偏離預(yù)期的信息。這個(gè)值等于觀測(cè)到的Bray-Curtis和零分布之間的偏差,范圍是-1到+1。| RCbray |<0.95可以解釋為終止過(guò)程的影響。反過(guò)來(lái),擴(kuò)散限制加上漂移導(dǎo)致大于預(yù)期的周轉(zhuǎn)率(RCbray>+0.95),而RCbray<-0.95則表明群落組成的周轉(zhuǎn)率主要受均勻擴(kuò)散控制。

參考文獻(xiàn):Jizhong, Zhou, Daliang, et al. Stochastic Community Assembly: Does It Matter in Microbial Ecology[J]. Microbiology & Molecular Biology Reviews, 2017.

]]>
【一作解讀】高分辨率時(shí)空動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)錄組景觀揭示陸地棉中GhCAL介導(dǎo)的開花調(diào)控途徑? http://30687.cn/archives/5445 Wed, 09 Sep 2020 08:05:00 +0000 http://30687.cn/?p=5445

文章題目:High-resolution temporal dynamic transcriptome landscape reveals a GhCAL-mediated flowering regulatory pathway in cotton (Gossypium hirsutum L.)

發(fā)表期刊:Plant Biotechnology Journal

發(fā)表時(shí)間:2020年7月12

影響因子:8.1

研究?jī)?nèi)容:棉花花芽分化

研究對(duì)象:兩個(gè)早熟品種,兩個(gè)晚熟品種;每個(gè)品種6個(gè)時(shí)期

研究方法:轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

 

前言

陸地棉(Gossypium hirsutum L.)是世界上最重要的纖維作物。在我國(guó)黃河流域和長(zhǎng)江流域棉區(qū),實(shí)現(xiàn)早熟棉在小麥或者油菜后直播可以提高復(fù)種指數(shù)。而在西北內(nèi)陸棉區(qū),春季氣溫低,秋季枯霜早,早熟棉既能提高棉花的霜前花率,還可以改善棉花品質(zhì)?;ㄑ糠只怯绊懚碳久奁贩N早熟的重要性狀,是棉花現(xiàn)蕾期、開花期和成鈴期發(fā)育的基礎(chǔ),花芽分化直接影響開花時(shí)間?;ㄑ糠只侵参飶臓I(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)過(guò)渡的標(biāo)志。當(dāng)進(jìn)入生殖生長(zhǎng)時(shí),側(cè)芽變成花芽,花芽發(fā)育成果枝。果枝分化決定了開花量、生殖能力和棉花產(chǎn)量。因此,早熟性狀及早熟棉品種在生產(chǎn)上顯得尤為重要。

 

結(jié)果

1、棉花莖尖的形態(tài)發(fā)育

在這項(xiàng)研究中,選擇了兩個(gè)早熟的陸地棉栽培品種CCRI50和Yanzao2,以及兩個(gè)晚熟的栽培品種國(guó)新棉11和STS458。與晚熟品種相比,早熟品種的花芽分化時(shí)間提前了10天,開花時(shí)間提前了19天,整個(gè)生長(zhǎng)期縮短了33天(圖1a)。石蠟切片的組織學(xué)分析表明,在早熟品種Yanzao2和CCRI50中,花芽分化出現(xiàn)在第三片真葉展平時(shí)期(3TLS),而晚熟品種在第五真葉(5TLS)才出現(xiàn)花芽分化。?
圖1兩個(gè)早熟品種和兩個(gè)晚熟品種的比較

 

2、棉花不同發(fā)育階段的72個(gè)RNA文庫(kù)的轉(zhuǎn)錄組譜

在這里,為了研究棉花早期成熟調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分子機(jī)制,我們選擇了兩個(gè)早熟品種和兩個(gè)晚熟品種,在花芽分化前后收集了莖尖樣品,并分析了它們的轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)。發(fā)現(xiàn)至少一個(gè)樣品中表達(dá)的基因共有49 000個(gè)。為了了解早熟和晚熟棉花品種發(fā)展的轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài),對(duì)所有樣品進(jìn)行了聚類分析(圖2a)和主成分分析(PCA)(圖2b)。結(jié)果表明,這些高密度時(shí)空轉(zhuǎn)錄本可以根據(jù)發(fā)育階段分為兩個(gè)類群,然后在每個(gè)類群中將早熟和晚熟品種分開。
?圖2早熟和晚熟品種六個(gè)發(fā)育階段之間的轉(zhuǎn)錄關(guān)系。

 

3、加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)

將5312個(gè)基因用于WGCNA,產(chǎn)生10個(gè)不同的模塊(標(biāo)有不同的顏色)(圖3a,b)。幾乎80%的基因聚集在發(fā)育階段的模塊中(MEcyan,Megreen,MElightgreen,MEtan,MEsalmon和MEturquoise)(圖3b)。這些基因的動(dòng)態(tài)和階段或品種特異性表達(dá)模式可能反映了它們發(fā)揮的關(guān)鍵功能。
?圖3差異表達(dá)基因的WGCNA

 

4、棉花從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換相關(guān)基因的鑒定

MElightcyan模塊包含46個(gè)基因,其中包括29個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。這些基因的表達(dá)模式與花芽分化階段相吻合,在3TLS時(shí)表達(dá),并且兩個(gè)早熟品種中這些基因的表達(dá)水平始終高于兩個(gè)晚熟品種中的表達(dá)水平(圖4a)。在這個(gè)模塊中,GH_D07G0876的連接線(邊緣)數(shù)量最多,這是AtCAL基因的同源基因,命名為GhCAL(圖4c)。
?圖4模塊MElightcyan的分析

5、GhCAL在調(diào)節(jié)從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)換的功能驗(yàn)證

GhCAL過(guò)表達(dá)能夠使擬南芥顯著早花。GhCAL沉默的轉(zhuǎn)基因棉花顯著晚花,花芽分化與野生型相比顯著推遲。GhCAL表達(dá)的下降延遲了棉花從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的過(guò)渡。?
6、病毒誘導(dǎo)的GhAGL6-D09和GhAP1-A04沉默導(dǎo)致棉花開花延遲

為了探索GhCAL如何調(diào)節(jié)棉花開花,分析了以GhCAL為中心的WGCNA基因網(wǎng)絡(luò)中具有更多連接線(邊緣)的其他基因的表達(dá)。編碼AGL6同源基因的GH_D09G0468和編碼AP1同源基因的GH_A04G1749分別被命名為GhAGL6-D09和GhAP1-A04。在GhCAL沉默的轉(zhuǎn)基因棉花品系中,GhAGL6-D09和GhAP1-A04的表達(dá)明顯較低,這可能是由于GhCAL表達(dá)的降低導(dǎo)致的,表明AGL6和AP1受GhCAL調(diào)控。GhAGL6-D09和?GhAP1-A04過(guò)表達(dá)能夠使擬南芥開花時(shí)間明顯提前。同時(shí),GhAGL6-D09和?GhAP1-A04沉默的棉花植株與對(duì)照相比,花芽分化和開花時(shí)間顯著推遲。
7、GhCAL-D07能夠與GhAGL6-D09 / GhAP1-A04形成異源二聚體

先前的研究表明,某些MADSbox轉(zhuǎn)錄因子可能形成異二聚體以發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。酵母雙雜交(Y2H)和雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)分析表明,GhCAL,GhAGL6-D09和GhAP1-A04這三種蛋白質(zhì)彼此相互作用,形成異二聚體。在擬南芥中,MADS-box轉(zhuǎn)錄因子可以形成特異性異二聚體,該異源二聚體與自身啟動(dòng)子區(qū)域的CArG-box結(jié)合并調(diào)節(jié)其自身表達(dá)。GhCAL可能與GhAGL6-D09和GhAP1-A04形成異源二聚體,結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)域的CArG-box,然后調(diào)節(jié)它們的表達(dá)。
8、GhCAL通過(guò)調(diào)節(jié)GhAP1A04和GhAGL6-D09介導(dǎo)棉花營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)換的調(diào)控途徑

在早熟品種中,GhCAL在3TLS表達(dá)。GhCAL與GhAGL6-D09形成異二聚體,可能與GhAGL6-D09啟動(dòng)子區(qū)域的CArG-box結(jié)合并誘導(dǎo)GhAGL6-D09的表達(dá)以啟動(dòng)花芽分化。在5TLS時(shí),GhCAL / GhAGL6與GhAP1-A04形成異二聚體,可能與GhAP1-A04啟動(dòng)子區(qū)域的CArG-box結(jié)合并誘導(dǎo)GhAP1-A04的表達(dá)。GhCAL充當(dāng)整個(gè)途徑的調(diào)節(jié)中心,調(diào)節(jié)棉花從營(yíng)養(yǎng)期到生殖期的過(guò)渡,以誘導(dǎo)開花。
小編說(shuō):本篇文章思路清晰,有幸和一作溝通后編輯此文,從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)到后續(xù)的數(shù)據(jù)挖掘,功能驗(yàn)證穩(wěn)扎穩(wěn)打。那么作者是如何進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及我們是否有值得學(xué)習(xí)和參考的地方呢?
首先作者挑選兩個(gè)早熟,兩個(gè)晚熟材料進(jìn)行表型調(diào)查和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后,拿到所有基因表達(dá)量數(shù)據(jù)后對(duì)表達(dá)量篩選,做了聚類圖和PCA,發(fā)現(xiàn)根據(jù)表達(dá)量可以把不同性狀、不同發(fā)育時(shí)期進(jìn)行分類。
百邁客云平臺(tái)可以在所有基因挖掘這里進(jìn)行所有基因篩選和PCA聚類(動(dòng)圖是示例數(shù)據(jù))

 

然后作者利用高分文章利器:WGCNA分析,進(jìn)行數(shù)據(jù)深度挖掘和整理,推薦大家使用百邁客云平臺(tái)小工具WGCNA模塊,可以出來(lái)和作者同樣高大上的圖片。

登陸百邁客云平臺(tái)—小工具,即可使用分析(動(dòng)圖是示例數(shù)據(jù))

 

然后作者根據(jù)一系列的功能驗(yàn)證最終鎖定控制花芽分化的基因,再次推薦大家使用百邁客轉(zhuǎn)錄組個(gè)性化(所有基因挖掘,差異基因挖掘,基因結(jié)構(gòu)挖掘)三大模塊和小工具(108款分析繪圖工具),下一篇高分文章就是你!

 

]]>
這個(gè)課題組如何做到2年連發(fā)6篇文章? http://30687.cn/archives/5385 Mon, 07 Sep 2020 05:39:41 +0000 http://30687.cn/?p=5385 對(duì)于剛接觸高通量測(cè)序的小碩小博來(lái)說(shuō),海量的測(cè)序數(shù)據(jù)和難于上青天的分析結(jié)果讓每一個(gè)初次接觸它的老師們都望而生畏。同樣的測(cè)序數(shù)據(jù)在生信大神的手里妙筆生花,開出一朵朵美麗而迷人的SCI論文。同為科研人的你,甚至自己想要的結(jié)果文件都不知道在哪里找。而這個(gè)研究小麥課題的老師,做到了什么才能在短短兩年之內(nèi)發(fā)6篇測(cè)序相關(guān)的文章呢?

作為一個(gè)科技服務(wù)工作者,自然能夠明白每一位老師的痛處和難點(diǎn),不過(guò)現(xiàn)在都2020年了,再也不是一個(gè)轉(zhuǎn)錄組1萬(wàn)元的天價(jià)了,那么現(xiàn)在從原始的測(cè)序數(shù)據(jù)到數(shù)據(jù)挖掘直至最后完美的SCI論文圖表,究竟是怎么出來(lái)呢?

雖然君子遠(yuǎn)庖廚,不過(guò)今天小編將為您帶進(jìn)后廚,為您娓娓道來(lái)。

 

1、首先我們需要原始數(shù)據(jù)

這部分?jǐn)?shù)據(jù)一般來(lái)自于兩種渠道:一種是老師做的建庫(kù)測(cè)序后拿到的原始數(shù)據(jù),這部分?jǐn)?shù)據(jù)可以直接保存在百邁客云賬號(hào)下;另一種來(lái)自于已發(fā)表的轉(zhuǎn)錄組文章中的原始數(shù)據(jù),關(guān)于這部分?jǐn)?shù)據(jù),老師可以在NCBI上根據(jù)文章的鏈接查找下載,然后直接將數(shù)據(jù)保存在自己的賬號(hào)下,然后進(jìn)行后續(xù)分析。

2、一分鐘的分析任務(wù)投遞

選擇合適的分析APP

 

命名和選擇數(shù)據(jù)

 

 

選擇參考基因組及設(shè)置差異分組

 

任務(wù)提交后,根據(jù)樣本數(shù)據(jù)量,一般24-48h左右大家就可以看到一份完整的分析結(jié)題報(bào)告和分析數(shù)據(jù)了。


講到這里可能有人會(huì)問(wèn):難道就這么簡(jiǎn)單?那人家好幾篇文章里面那些高大上的圖片都是大神用小工具做的嗎,小編可以負(fù)責(zé)任的告訴你們,不是的!我們還有很多隱藏功能

第一:基因檢索。(小編選的蛋白是PPR蛋白,從4萬(wàn)多基因里面篩選出來(lái)60個(gè)PPR蛋白相關(guān)的基因,然后根據(jù)60個(gè)基因做GO分類圖)。

 

第二:WGCNA分析。這個(gè)分析主要是將基因模塊與表型數(shù)據(jù)或者表型樣本進(jìn)行關(guān)聯(lián),從而快速的鎖定一批候選基因。

 

 

運(yùn)行后打開是下圖這樣的,對(duì)此圖有疑惑的可以點(diǎn)擊圖片左側(cè)的攝像頭。

 

 

第三:最近很火的差異基因表達(dá)趨勢(shì)分析

 

 

第四:108款分析繪圖工具(73款常用工具免費(fèi)使用)。

 

具體這些工具如何使用?百邁客云還有哪些隱藏功能呢?歡迎大家持續(xù)關(guān)注,小編會(huì)定期為大家進(jìn)行分享

 

 

 

 

]]>
真核轉(zhuǎn)錄組主流程任務(wù)投遞說(shuō)明 http://30687.cn/archives/5289 Fri, 28 Aug 2020 06:19:21 +0000 http://30687.cn/?p=5289 一、登錄百邁客云平臺(tái)

下載谷歌瀏覽器,輸入網(wǎng)址https://international.biocloud.net/zh/user/login?,進(jìn)入百邁客云平臺(tái)登錄界面,輸入賬號(hào)密碼登錄。賬號(hào)為手機(jī)號(hào)或者是郵箱,初始密碼為123.bmk.

 

二、選擇合適的分析平臺(tái)

百邁客云包含農(nóng)學(xué)和醫(yī)學(xué)兩大類分析平臺(tái),醫(yī)學(xué)分析平臺(tái)主要針對(duì)人、鼠數(shù)據(jù)的分析,包含:轉(zhuǎn)錄組、非編碼RNA、單基因病外顯子、腫瘤外顯子、重測(cè)序等數(shù)據(jù)分析,以及全轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析;農(nóng)學(xué)分析平臺(tái)可以應(yīng)用到更多的物種,涵蓋轉(zhuǎn)錄組、非編碼RNA、微生物、蛋白、代謝等數(shù)據(jù)的分析,以及全轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析等。點(diǎn)擊左側(cè)導(dǎo)航分析->農(nóng)學(xué)或者醫(yī)學(xué)打開分析平臺(tái)列表頁(yè)面,點(diǎn)擊選擇您想要使用的分析平臺(tái),打開其詳細(xì)介紹頁(yè)面,該頁(yè)面可以看到該平臺(tái)的應(yīng)用領(lǐng)域“平臺(tái)介紹“技術(shù)背景“案例“課堂“版本記錄,點(diǎn)擊打開軟件即可進(jìn)入到參數(shù)頁(yè)面。

 

 

三、創(chuàng)建項(xiàng)目名稱

為了方便數(shù)據(jù)、任務(wù)和報(bào)告的管理,我們將同屬于一個(gè)項(xiàng)目的內(nèi)容會(huì)放到一個(gè)項(xiàng)目中,因此進(jìn)行基本分析時(shí)需要先選擇一個(gè)項(xiàng)目,如果沒有項(xiàng)目也可以點(diǎn)擊+新建先創(chuàng)建一個(gè)項(xiàng)目,見下圖。

 

 

四、數(shù)據(jù)導(dǎo)入

針對(duì)FASTQ測(cè)序數(shù)據(jù),選擇文件夾批量導(dǎo)入,雙端測(cè)序數(shù)據(jù)必須分別以_1.fq和_2.fq結(jié)尾,系統(tǒng)便會(huì)自動(dòng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì),而且多個(gè)目錄中的文件可以分多次導(dǎo)入進(jìn)來(lái)一起進(jìn)行分析。(在本公司進(jìn)行測(cè)序的數(shù)據(jù)會(huì)自動(dòng)推送到您的賬戶下,數(shù)據(jù)所在文件夾名稱為合同編號(hào))

導(dǎo)入數(shù)據(jù)之后,可以根據(jù)自己的需要修改樣品ID,由于此處設(shè)置的ID會(huì)體現(xiàn)在分析報(bào)告和分析結(jié)果中,因此請(qǐng)慎重考慮后再設(shè)置,分析完成后不可再次修改。如果平臺(tái)上還沒有您自己的數(shù)據(jù),請(qǐng)參考數(shù)據(jù)上傳先將您的數(shù)據(jù)傳到云平臺(tái)上。

 

 

四、基本參數(shù)設(shè)置

一般在這里選擇生信流程版本、設(shè)置報(bào)告名稱等基本參數(shù),如果對(duì)于參數(shù)設(shè)置沒有特殊要求,推薦使用默認(rèn)參數(shù)。

 

五、選擇參考基因組(有參)

對(duì)于依賴參考基因組序列進(jìn)行分析的平臺(tái),一定要選擇和分析數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)的參考物種及組裝版本,不同版本的參考基因組的詳細(xì)信息可以點(diǎn)擊基因組版本詳情進(jìn)行查看。(一個(gè)項(xiàng)目只能使用一個(gè)版本的參考基因組進(jìn)行分析)

 

 

六、基因功能注釋(無(wú)參)

  1. 組裝方式:

轉(zhuǎn)錄組組裝方式?jīng)Q定了后續(xù)Unigenes庫(kù)的構(gòu)建和表達(dá)定量的策略以及分析結(jié)果的可靠性.根據(jù)實(shí)際情況選擇轉(zhuǎn)錄組組裝方式。分開組裝是對(duì)每個(gè)樣品數(shù)據(jù)單 獨(dú)組裝;合并組裝是將所有樣品放在一起組裝;分組組裝適合于不同品種(或者是變異種)的組裝,將相同品種的樣品合并組裝,然后將每組的組裝結(jié)果 進(jìn)行合并去冗余。合并組裝獲得的Unigene庫(kù)更完整、冗余度更低,因此Trinity官方亦推薦使用合并組裝,以便進(jìn)行后續(xù)的表達(dá)定量和差異表達(dá)分析.

  1. 注釋物種

為了提高注釋分析的效率(縮短比對(duì)比對(duì)時(shí)間)以及獲得有效的注釋信息,在選擇注釋物種時(shí),應(yīng)盡量選擇包含物種最確切的數(shù)據(jù)庫(kù).(如果分析物種為真菌類,一定要選擇真菌選項(xiàng),否則會(huì)影響組裝效果)

 

 

七、差異分組設(shè)置

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)以及樣品信息,進(jìn)行分組的設(shè)置,流程據(jù)此進(jìn)行差異比較分析,此處只支持兩組間比較,可添加多個(gè)差異分組。FDR值一般推薦選擇0.01,差異倍數(shù)閾值一般推薦選擇(此處的參數(shù)和差異分組在后期報(bào)告?zhèn)€性化中可再次進(jìn)行修改)

 

八、生成標(biāo)準(zhǔn)分析報(bào)告

參數(shù)設(shè)置完成之后,可以點(diǎn)擊保存參數(shù),方便之后進(jìn)行重新分析或者基于本次參數(shù)進(jìn)行修改后再次分析;一切準(zhǔn)備就緒后,點(diǎn)擊提交將任務(wù)提交到百邁客云計(jì)算集群上,根據(jù)不同分析平臺(tái)、不同數(shù)據(jù)量等待大概2小時(shí)到3周的時(shí)間完成項(xiàng)目分析,獲取到標(biāo)準(zhǔn)分析報(bào)告。

報(bào)告查看,點(diǎn)擊項(xiàng)目(管理)?->?我的項(xiàng)目打開項(xiàng)目列表,找到之前提交任務(wù)時(shí)選擇的項(xiàng)目,點(diǎn)擊項(xiàng)目名稱打開該項(xiàng)目,即可看到新生成的分析報(bào)告記錄,點(diǎn)擊報(bào)告名稱查看詳細(xì)報(bào)告。

點(diǎn)擊報(bào)告右上角的項(xiàng)目結(jié)果下載,可以選擇下載HTML報(bào)告、PDF報(bào)告和結(jié)果數(shù)據(jù)(尾款結(jié)清后)。HTML報(bào)告只包括分析報(bào)告的html文件及一個(gè)src文件夾,展示了部分結(jié)果;PDF報(bào)告是根據(jù)HTML報(bào)告轉(zhuǎn)換而來(lái),方便您進(jìn)行報(bào)告打印;結(jié)果數(shù)據(jù)包含了項(xiàng)目中所有結(jié)果文件,一般比較大,會(huì)通過(guò)FTP進(jìn)行下載,請(qǐng)耐心等待下載。

 

]]>
全轉(zhuǎn)錄組主流程任務(wù)投遞說(shuō)明 http://30687.cn/archives/5233 Fri, 28 Aug 2020 05:40:52 +0000 http://30687.cn/?p=5233 一、登錄百邁客云平臺(tái)

下載谷歌瀏覽器,輸入網(wǎng)址https://international.biocloud.net/zh/user/login?,進(jìn)入百邁客云平臺(tái)登錄界面,輸入賬號(hào)密碼登錄。賬號(hào)為手機(jī)號(hào)或者是郵箱,初始密碼為123.bmk.

 

二、選擇合適的分析平臺(tái)

百邁客云包含農(nóng)學(xué)和醫(yī)學(xué)兩大類分析平臺(tái),醫(yī)學(xué)分析平臺(tái)主要針對(duì)人、鼠數(shù)據(jù)的分析,包含:轉(zhuǎn)錄組、非編碼RNA、單基因病外顯子、腫瘤外顯子、重測(cè)序等數(shù)據(jù)分析,以及全轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析;農(nóng)學(xué)分析平臺(tái)可以應(yīng)用到更多的物種,涵蓋轉(zhuǎn)錄組、非編碼RNA、微生物、蛋白、代謝等數(shù)據(jù)的分析,以及全轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析等。點(diǎn)擊左側(cè)導(dǎo)航分析->農(nóng)學(xué)或者醫(yī)學(xué)打開分析平臺(tái)列表頁(yè)面,點(diǎn)擊選擇您想要使用的分析平臺(tái),打開其詳細(xì)介紹頁(yè)面,該頁(yè)面可以看到該平臺(tái)的應(yīng)用領(lǐng)域“平臺(tái)介紹“技術(shù)背景“案例“課堂“版本記錄,點(diǎn)擊打開軟件即可進(jìn)入到參數(shù)頁(yè)面。

 

三、創(chuàng)建項(xiàng)目名稱

為了方便數(shù)據(jù)、任務(wù)和報(bào)告的管理,我們將同屬于一個(gè)項(xiàng)目的內(nèi)容會(huì)放到一個(gè)項(xiàng)目中,因此進(jìn)行基本分析時(shí)需要先選擇一個(gè)項(xiàng)目,如果沒有項(xiàng)目也可以點(diǎn)擊+新建先創(chuàng)建一個(gè)項(xiàng)目,見下圖。

 

四、數(shù)據(jù)導(dǎo)入

針對(duì)FASTQ測(cè)序數(shù)據(jù),選擇文件夾批量導(dǎo)入,雙端測(cè)序數(shù)據(jù)必須分別以_1.fq和_2.fq結(jié)尾,系統(tǒng)便會(huì)自動(dòng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì),而且多個(gè)目錄中的文件可以分多次導(dǎo)入進(jìn)來(lái)一起進(jìn)行分析。(在本公司進(jìn)行測(cè)序的數(shù)據(jù)會(huì)自動(dòng)推送到您的賬戶下,數(shù)據(jù)所在文件夾名稱為合同編號(hào))

導(dǎo)入數(shù)據(jù)之后,可以根據(jù)自己的需要修改樣品ID,由于此處設(shè)置的ID會(huì)體現(xiàn)在分析報(bào)告和分析結(jié)果中,因此請(qǐng)慎重考慮后再設(shè)置,分析完成后不可再次修改。如果平臺(tái)上還沒有您自己的數(shù)據(jù),請(qǐng)參考數(shù)據(jù)上傳先將您的數(shù)據(jù)傳到云平臺(tái)上。

!注:1.各組學(xué)導(dǎo)入數(shù)據(jù)樣本個(gè)數(shù)要一致

????2.circRNA數(shù)據(jù)選擇去核糖體建庫(kù)則與lncRNA共用一套數(shù)據(jù),無(wú)需單獨(dú)導(dǎo)入(百邁客建庫(kù)方法為去核糖體建庫(kù));選擇去線性建庫(kù)則需要單獨(dú)導(dǎo)入數(shù)據(jù)

 

 

五、選擇樣本對(duì)應(yīng)關(guān)系

為了方便后面的聯(lián)合分析內(nèi)容,需要將各RNA項(xiàng)目里的數(shù)據(jù)按照對(duì)應(yīng)關(guān)系統(tǒng)一編號(hào),有幾組對(duì)應(yīng)關(guān)系則在左側(cè)添加幾組,再?gòu)挠覀?cè)的lncRNA樣品池和miRNA樣品池中選擇對(duì)應(yīng)的樣本添加到分組。其中默認(rèn)按鈕可以按照數(shù)字的順序快速添加對(duì)應(yīng)關(guān)系。

 

 

六、選擇參考基因組

對(duì)于依賴參考基因組序列進(jìn)行分析的平臺(tái),一定要選擇和分析數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)的參考物種及組裝版本,不同版本的參考基因組的詳細(xì)信息可以點(diǎn)擊基因組版本詳情進(jìn)行查看。如果云上沒有您需要的參考基因組,您可以聯(lián)系對(duì)應(yīng)的運(yùn)營(yíng)將您提供的基因組文件部署到云平臺(tái)上,供您使用。(注:一個(gè)項(xiàng)目只能使用一個(gè)版本的參考基因組進(jìn)行分析)

 

 

七、參數(shù)設(shè)置

  1. 流程版本號(hào)可以選擇默認(rèn)的最新版本

Lib_type為窗體頂端

  1. Lib_type :lncRNA建庫(kù)方式,fr-firststrand表示測(cè)序數(shù)據(jù)中,reads2方向與轉(zhuǎn)錄本方向一致;fr-unstranded為非鏈特異性建庫(kù);fr-secondstrand 表示read1方向與轉(zhuǎn)錄本方向一致(百邁客lncRNA的建庫(kù)方式為fr-firststrand)
  2. lncRNA分析中反式靶基因預(yù)測(cè)方法: 樣本少的時(shí)候可以選擇基于序列方法,樣本數(shù)較多(大于5)推薦使用基于共表達(dá)分析方法。
  3. miRNA的長(zhǎng)度范圍和接頭序列可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行填寫,主要是為了過(guò)濾原始數(shù)據(jù)中的街頭,默認(rèn)參數(shù)為百邁客使用的序列
  4. circRNA預(yù)測(cè)軟件:給出三種預(yù)測(cè)方法,CIRI和find_circ是兩個(gè)不同的預(yù)測(cè)軟件,可以分別選擇其中一個(gè)軟件進(jìn)行預(yù)測(cè),CIRI+find_circ是將兩個(gè)軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果取交集作為最終的結(jié)果,(此選項(xiàng)可能會(huì)導(dǎo)致預(yù)測(cè)結(jié)果偏少)

八、差異分組設(shè)置

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)以及樣品信息,進(jìn)行分組的設(shè)置,流程據(jù)此進(jìn)行差異比較分析,此處只支持兩組間比較,可添加多個(gè)差異分組。

DEseq2軟件適用于有生物學(xué)重復(fù)的項(xiàng)目,edgeR適用于無(wú)生物學(xué)重復(fù)的項(xiàng)目,選擇第一個(gè),系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)識(shí)別項(xiàng)目類型選擇對(duì)應(yīng)的軟件

  1. FDR值一般推薦選擇0.01,差異倍數(shù)閾值一般推薦選擇2.(此處設(shè)置的的參數(shù)和差異分組在后期報(bào)告?zhèn)€性化中可再次進(jìn)行修改)

 

九、聯(lián)合分析參數(shù)

  1. 構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的篩選條件為共表達(dá)相關(guān)性閾值和共表達(dá)相關(guān)性分析中顯著性閾值兩個(gè)參數(shù),其中共表達(dá)相關(guān)性閾值越大,顯著性閾值越小,則條件越嚴(yán)格。
  2. 構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)的關(guān)系對(duì)的篩選條件為ceRNA超幾何檢驗(yàn)fdr值、ceRNA超幾何檢驗(yàn)p值、ceRNA共享的miRNA數(shù)目三個(gè)參數(shù),其中fdr值和P值越小,共享miRNA數(shù)目越大則篩選條件越嚴(yán)格。
  3. 圖中參數(shù)為推薦參數(shù)

 

十、生成標(biāo)準(zhǔn)分析報(bào)告

參數(shù)設(shè)置完成之后,可以點(diǎn)擊保存參數(shù),方便之后進(jìn)行重新分析或者基于本次參數(shù)進(jìn)行修改后再次分析;一切準(zhǔn)備就緒后,點(diǎn)擊提交將任務(wù)提交到百邁客云計(jì)算集群上,根據(jù)不同分析平臺(tái)、不同數(shù)據(jù)量等待大概2小時(shí)到3周的時(shí)間完成項(xiàng)目分析,獲取到標(biāo)準(zhǔn)分析報(bào)告。

報(bào)告查看,點(diǎn)擊項(xiàng)目(管理)?->?我的項(xiàng)目打開項(xiàng)目列表,找到之前提交任務(wù)時(shí)選擇的項(xiàng)目,點(diǎn)擊項(xiàng)目名稱打開該項(xiàng)目,即可看到新生成的分析報(bào)告記錄,點(diǎn)擊報(bào)告名稱查看詳細(xì)報(bào)告。

點(diǎn)擊報(bào)告右上角的項(xiàng)目結(jié)果下載,可以選擇下載HTML報(bào)告、PDF報(bào)告和結(jié)果數(shù)據(jù)(尾款結(jié)清后)。HTML報(bào)告只包括分析報(bào)告的html文件及一個(gè)src文件夾,展示了部分結(jié)果;PDF報(bào)告是根據(jù)HTML報(bào)告轉(zhuǎn)換而來(lái),方便您進(jìn)行報(bào)告打??;結(jié)果數(shù)據(jù)包含了項(xiàng)目中所有結(jié)果文件,一般比較大,會(huì)通過(guò)FTP進(jìn)行下載

 

]]>
蛋白主流程任務(wù)投遞說(shuō)明 http://30687.cn/archives/5189 Thu, 27 Aug 2020 03:06:17 +0000 http://30687.cn/?p=5189 一、登錄百邁客云平臺(tái)

下載谷歌瀏覽器,輸入網(wǎng)址https://international.biocloud.net/zh/user/login?,進(jìn)入百邁客云平臺(tái)登錄界面,輸入賬號(hào)密碼登錄。賬號(hào)為手機(jī)號(hào)或者是郵箱,初始密碼為123.bmk.

二、選擇合適的分析平臺(tái)

百邁客云包含農(nóng)學(xué)和醫(yī)學(xué)兩大類分析平臺(tái),醫(yī)學(xué)分析平臺(tái)主要針對(duì)人、鼠數(shù)據(jù)的分析,包含:轉(zhuǎn)錄組、非編碼RNA、單基因病外顯子、腫瘤外顯子、重測(cè)序等數(shù)據(jù)分析,以及全轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析;農(nóng)學(xué)分析平臺(tái)可以應(yīng)用到更多的物種,涵蓋轉(zhuǎn)錄組、非編碼RNA、微生物、蛋白、代謝等數(shù)據(jù)的分析,以及全轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析等。點(diǎn)擊左側(cè)導(dǎo)航分析->農(nóng)學(xué)或者醫(yī)學(xué)打開分析平臺(tái)列表頁(yè)面,點(diǎn)擊選擇您想要使用的分析平臺(tái),打開其詳細(xì)介紹頁(yè)面,該頁(yè)面可以看到該平臺(tái)的應(yīng)用領(lǐng)域“平臺(tái)介紹“技術(shù)背景“案例“課堂“版本記錄,點(diǎn)擊打開軟件即可進(jìn)入到參數(shù)頁(yè)面。

 

 

三、創(chuàng)建項(xiàng)目名稱

為了方便數(shù)據(jù)、任務(wù)和報(bào)告的管理,我們將同屬于一個(gè)項(xiàng)目的內(nèi)容會(huì)放到一個(gè)項(xiàng)目中,因此進(jìn)行基本分析時(shí)需要先選擇一個(gè)項(xiàng)目,如果沒有項(xiàng)目也可以點(diǎn)擊+新建先創(chuàng)建一個(gè)項(xiàng)目,見下圖。

 

四、選擇輸入文件

  1. 蛋白鑒定表格:蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定的結(jié)果表格。制表符分隔的文本文件,第一列為蛋白ID,其他列為樣品的表達(dá)量。對(duì)格式不清楚的可點(diǎn)擊查看示例下載示例文件。(百邁客項(xiàng)目的結(jié)果文件會(huì)直接推送到客戶賬號(hào)下,文件夾名稱為合同編號(hào),可直接導(dǎo)入使用)
  2. 蛋白數(shù)據(jù)庫(kù):蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定所用的數(shù)據(jù)庫(kù)。不同數(shù)據(jù)庫(kù)得到的蛋白ID格式不同。這里給出了常用的uniport數(shù)據(jù)庫(kù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)。如果需要和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析,建議使用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù),并且可以輸入轉(zhuǎn)錄組的注釋信息文件,百邁客的轉(zhuǎn)錄組項(xiàng)目會(huì)自動(dòng)生成此文件,也可以下載示例查看具體的格式)。

五、綜合選項(xiàng)

  1. 流程版本:選擇最新的版本(目前為0)
  2. Kegg注釋物種分類:點(diǎn)擊下拉框選擇KEGG注釋所用的物種類別
  3. 報(bào)告名稱:可以自定義方便區(qū)分的報(bào)告名稱,可以使用默認(rèn)名稱
  4. 物種名稱:支持自定義物種名稱,與后期生成的任務(wù)名稱相關(guān)聯(lián)
  5. 標(biāo)準(zhǔn)化方式::不進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化;總峰面積:表示每個(gè)樣本中的每個(gè)蛋白除以該樣本總的峰面積;加和方法:先計(jì)算單個(gè)樣本所有蛋白的sum值, 再用sum值除以幾個(gè)樣本sum值中最大的,得到偏差系數(shù),最后用蛋白/樣本的偏差系數(shù)得到標(biāo)準(zhǔn)化后的值。此處iTRAQ項(xiàng)目數(shù)據(jù)已經(jīng)進(jìn)行過(guò)歸一化,可以選擇否,lable-free項(xiàng)目推薦總峰面積

 

六、差異分組設(shè)置

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)以及樣品信息,進(jìn)行分組的設(shè)置,流程據(jù)此進(jìn)行差異比較分析,此處只支持兩組間比較,可添加多個(gè)差異分組。

  1. pvalue值一般推薦選擇0.01,差異倍數(shù)閾值一般推薦選擇2.(此處設(shè)置的的參數(shù)和差異分組在后期報(bào)告?zhèn)€性化中可再次進(jìn)行修改)
  2. 分組設(shè)置:有幾組生物學(xué)重復(fù)就在左側(cè)的分組池中添加相應(yīng)數(shù)量的分組,再?gòu)挠覀?cè)的樣品池中選樣本加入相應(yīng)的分組中,1個(gè)樣本只能屬于一個(gè)分組且一個(gè)分組的樣本數(shù)目不少于2個(gè)(這里需要修改分組名稱,分析完成后不可修改)
  3. 差異分組設(shè)置

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)以及樣品信息,進(jìn)行分組的設(shè)置,流程據(jù)此進(jìn)行差異比較分析,此處只支持兩組間比較,可添加多個(gè)差異分組。(此處的參數(shù)和差異分組在后期報(bào)告?zhèn)€性化中可再次進(jìn)行修改)

 

 

七、生成標(biāo)準(zhǔn)分析報(bào)告

參數(shù)設(shè)置完成之后,可以點(diǎn)擊保存參數(shù),方便之后進(jìn)行重新分析或者基于本次參數(shù)進(jìn)行修改后再次分析;一切準(zhǔn)備就緒后,點(diǎn)擊提交將任務(wù)提交到百邁客云計(jì)算集群上,根據(jù)不同分析平臺(tái)、不同數(shù)據(jù)量等待大概2小時(shí)到3周的時(shí)間完成項(xiàng)目分析,獲取到標(biāo)準(zhǔn)分析報(bào)告。

報(bào)告查看,點(diǎn)擊項(xiàng)目(管理)?->?我的項(xiàng)目打開項(xiàng)目列表,找到之前提交任務(wù)時(shí)選擇的項(xiàng)目,點(diǎn)擊項(xiàng)目名稱打開該項(xiàng)目,即可看到新生成的分析報(bào)告記錄,點(diǎn)擊報(bào)告名稱查看詳細(xì)報(bào)告。

點(diǎn)擊報(bào)告右上角的項(xiàng)目結(jié)果下載,可以選擇下載HTML報(bào)告、PDF報(bào)告和結(jié)果數(shù)據(jù)(尾款結(jié)清后)。HTML報(bào)告只包括分析報(bào)告的html文件及一個(gè)src文件夾,展示了部分結(jié)果;PDF報(bào)告是根據(jù)HTML報(bào)告轉(zhuǎn)換而來(lái),方便您進(jìn)行報(bào)告打??;結(jié)果數(shù)據(jù)包含了項(xiàng)目中所有結(jié)果文件,一般比較大,會(huì)通過(guò)FTP進(jìn)行下載,請(qǐng)耐心等待下載。

 

]]>
代謝組主流程任務(wù)投遞說(shuō)明 http://30687.cn/archives/5153 Thu, 27 Aug 2020 02:23:39 +0000 http://30687.cn/?p=5153 一、登錄百邁客云平臺(tái)

下載谷歌瀏覽器,輸入網(wǎng)址https://international.biocloud.net/zh/user/login?,進(jìn)入百邁客云平臺(tái)登錄界面,輸入賬號(hào)密碼登錄。賬號(hào)為手機(jī)號(hào)或者是郵箱,初始密碼為123.bmk.

二、選擇合適的分析平臺(tái)

百邁客云包含農(nóng)學(xué)和醫(yī)學(xué)兩大類分析平臺(tái),醫(yī)學(xué)分析平臺(tái)主要針對(duì)人、鼠數(shù)據(jù)的分析,包含:轉(zhuǎn)錄組、非編碼RNA、單基因病外顯子、腫瘤外顯子、重測(cè)序等數(shù)據(jù)分析,以及全轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析;農(nóng)學(xué)分析平臺(tái)可以應(yīng)用到更多的物種,涵蓋轉(zhuǎn)錄組、非編碼RNA、微生物、蛋白、代謝等數(shù)據(jù)的分析,以及全轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析等。點(diǎn)擊左側(cè)導(dǎo)航分析->農(nóng)學(xué)或者醫(yī)學(xué)打開分析平臺(tái)列表頁(yè)面,點(diǎn)擊選擇您想要使用的分析平臺(tái),打開其詳細(xì)介紹頁(yè)面,該頁(yè)面可以看到該平臺(tái)的應(yīng)用領(lǐng)域“平臺(tái)介紹“技術(shù)背景“案例“課堂“版本記錄,點(diǎn)擊打開軟件即可進(jìn)入到參數(shù)頁(yè)面。

 

三、創(chuàng)建項(xiàng)目名稱

為了方便數(shù)據(jù)、任務(wù)和報(bào)告的管理,我們將同屬于一個(gè)項(xiàng)目的內(nèi)容會(huì)放到一個(gè)項(xiàng)目中,因此進(jìn)行基本分析時(shí)需要先選擇一個(gè)項(xiàng)目,如果沒有項(xiàng)目也可以點(diǎn)擊+新建先創(chuàng)建一個(gè)項(xiàng)目,見下圖。

 

 

四、選擇輸入文件

代謝定量文件:針對(duì)鑒定到的代謝物進(jìn)行定量的結(jié)果表格。制表符分隔的文本文件,第一列為代謝物ID,其他列為樣品的表達(dá)量。對(duì)格式不清楚的可點(diǎn)擊查看示例下載示例文件。(百邁客項(xiàng)目的結(jié)果文件會(huì)直接推送到客戶賬號(hào)下,文件夾名稱為合同編號(hào),可直接導(dǎo)入使用)

 

五、綜合選項(xiàng)

  1. 流程版本:選擇最新的版本(目前為0)
  2. Kegg注釋物種分類:點(diǎn)擊下拉框選擇KEGG注釋所用的物種類別
  3. 報(bào)告名稱:可以自定義方便區(qū)分的報(bào)告名稱,可以使用默認(rèn)名稱
  4. 物種名稱:支持自定義物種名稱,與后期生成的任務(wù)名稱相關(guān)聯(lián)
  5. 標(biāo)準(zhǔn)化方式:表示不使用歸一化,總峰面積歸一化表示每個(gè)樣本中的每個(gè)代謝物除以該樣本總的峰面積,內(nèi)標(biāo)則是每個(gè)代謝物除以內(nèi)標(biāo)代謝物的峰面積且默認(rèn)內(nèi)標(biāo)的代謝物定性名稱為IS,內(nèi)標(biāo)不參與后續(xù)的分析。(LC推薦使用總峰面積,GC推薦使用內(nèi)標(biāo))

六、差異分組設(shè)置

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)以及樣品信息,進(jìn)行分組的設(shè)置,流程據(jù)此進(jìn)行差異比較分析,此處只支持兩組間比較,可添加多個(gè)差異分組。

  1. 推薦閾值選擇:(1)差異倍數(shù)閾值1、T檢驗(yàn)p值0.05、VIP值1 (2)差異倍數(shù)閾值2、T檢驗(yàn)p值1、VIP值1

(其中vip值采用了正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA),該分析會(huì)給每個(gè)代謝物一個(gè)變量投影重要度VIP值,值越大說(shuō)明代謝物的差異越顯著)

  1. 分組設(shè)置:有幾組生物學(xué)重復(fù)就在左側(cè)的分組池中添加相應(yīng)數(shù)量的分組,再?gòu)挠覀?cè)的樣品池中選樣本加入相應(yīng)的分組中,1個(gè)樣本只能屬于一個(gè)分組且一個(gè)分組的樣本數(shù)目不少于2個(gè)。(這里需要修改分組名稱,分析完成后不可修改)
  2. 差異分組設(shè)置:根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)以及樣品信息,進(jìn)行分組的設(shè)置,流程據(jù)此進(jìn)行差異比較分析,此處只支持兩組間比較,可添加多個(gè)差異分組。(此處的參數(shù)和差異分組在后期報(bào)告?zhèn)€性化中可再次進(jìn)行修改)

 

七、生成標(biāo)準(zhǔn)分析報(bào)告

參數(shù)設(shè)置完成之后,可以點(diǎn)擊保存參數(shù),方便之后進(jìn)行重新分析或者基于本次參數(shù)進(jìn)行修改后再次分析;一切準(zhǔn)備就緒后,點(diǎn)擊提交將任務(wù)提交到百邁客云計(jì)算集群上,根據(jù)不同分析平臺(tái)、不同數(shù)據(jù)量等待大概2小時(shí)到3周的時(shí)間完成項(xiàng)目分析,獲取到標(biāo)準(zhǔn)分析報(bào)告。

報(bào)告查看,點(diǎn)擊項(xiàng)目(管理)?->?我的項(xiàng)目打開項(xiàng)目列表,找到之前提交任務(wù)時(shí)選擇的項(xiàng)目,點(diǎn)擊項(xiàng)目名稱打開該項(xiàng)目,即可看到新生成的分析報(bào)告記錄,點(diǎn)擊報(bào)告名稱查看詳細(xì)報(bào)告。

點(diǎn)擊報(bào)告右上角的項(xiàng)目結(jié)果下載,可以選擇下載HTML報(bào)告、PDF報(bào)告和結(jié)果數(shù)據(jù)(尾款結(jié)清后)。HTML報(bào)告只包括分析報(bào)告的html文件及一個(gè)src文件夾,展示了部分結(jié)果;PDF報(bào)告是根據(jù)HTML報(bào)告轉(zhuǎn)換而來(lái),方便您進(jìn)行報(bào)告打??;結(jié)果數(shù)據(jù)包含了項(xiàng)目中所有結(jié)果文件,一般比較大,會(huì)通過(guò)FTP進(jìn)行下載,請(qǐng)耐心等待下載。

]]>
男人少妇A片免费叫少妇放荡,国产一级黄色现场视频在线观看,99热这里只有精品8 ,亚洲av片不卡无码久东京搔 最近免费的中文字幕一| 2019中文字幕V片在线 | 最新高清无码专区 | 91香蕉福利一区二区三区| 日本亚洲免费播放| 一级婬片AAAAAAA密柚| 变态另类欧美天堂网 | 成人免费无码大片a毛片| 最新亚洲人成无码网WWW电影| 国产精品精品国内自产拍| www.99热这里只有精品 | 高清三级精品国产 | 国产精品精品国内自产拍| 99国产成人精品在线观看| 成人精品免费网站| 27XXOO动态图178期试看| 91久久香蕉国产熟女线 | 国产激情久久99久久| 自拍视频在线观看视频精品| 99视频在线观看国产| 91久久香蕉国产熟女线 | 超碰在线播放97 | 久久无码一区二区三区少妇| 799999色色色色色44444 毛片| 国99精品无码一区二区三区| 给我免费看播放片| 成年美女少妇看黄片 | a a毛片免费在线播放| www.日本视频在线观看| 18禁超污无遮挡无码动态图| 久久久久久久岛国综合免费观看 | 成人午夜网址免费毛片| 成人三级欧美电影 | 丁香婷婷五月情天| 国产1024看片在线| 成年午夜无码AV片在线观看| 丰满的人妻hd高清完整版| 97久久香蕉国产线看观看| 波多野结衣av全免费观 | 最近最新中文字幕在线视频| 99热在线精品一区二区三区| 国产精品偷乱一区二区三区| 东京热加勒比hezyo一道高清| 不卡在线免费播放 | 91精品国产调教在线观看| av在线不卡网站无码18禁| 东北寡妇特级毛片免费| 国产AV天堂无码一区二区三区 | 成人深夜免费在线视频| 成人区人妻精品一区二区不卡视频 | 91免费国产视频| brazzershd欧美巨大| 日本亚洲免费播放| 99精品视频在线观看免费一| av免费在线观看香蕉 | 成人国产精品视频免费| 妇女高潮一区二区三区69 | heyzo色综合中文字幕无码| 顶级绝伦推理片密桃传媒 | 丰满的人妻hd高清完整版| japanese17一19hd| 2024丁香五月天之婷婷综合缴情| 最新国产日韩在线观看网站| 波多野结衣亚洲中文字幕| 91精品国产调教在线观看| 不带套绝色中出中文无码| 大香蕉在线综合在线观看| 91日韩欧美综合 | 最新在线观看国产小视频| 粉嫩国产精品呻吟高潮av| 高清欧美日韩中文字幕 | 成人免费毛片视频APP| 国产日精品久久久久久| 囯产av无码片毛片一级软件下载 | 国产av安全访问午夜福利| www.99热这里只有精品 | 动漫人物打扑克剧烈运动软件下载| 4438毛片视频网站| 自拍视频在线观看视频精品| 91精品综合久久久久五月天| 懂爱国产aⅴ丝袜一区二区三区| 岛国毛片在线播放一区二区| 大色香蕉网偷拍视频| 抱起来内射丰满少妇视频| 91精品国产高清久久久电影| 够浪的熟妇让你爽视频| 国产AV国片精品有毛| 国产av毛片一区二区 | 99久久精品精品6精品精品 | 17岁中国高清免费完整版| japanese17一19hd| 成人性生交A片免费看麻豆| www.亚洲中文字幕在线观看 | 176精品二区免费视频| 成年美女少妇看黄片 | 51avi在线视频| 2025老司机导航| 懂爱国产aⅴ丝袜一区二区三区| 精品成人无码一区二区久| 99日韩精品视频| 丰满少妇一级一区二区| 97人妻成人免费视频| 高清毛片无遮挡免费视频| 97精品伊人久久久大香线蕉| 返回码: 404 网站打不开 重查| 欧美日韩老女人aaaaaa| 国产AV片一区二区三区| 亚洲无码一区二区av| 69精品丰满人妻无码视频A片 | 99久久国产综合精麻豆| 俄罗斯老熟女又乱又伦 | 动漫熟女制服一区二区 | 边吃奶边添下面好爽| 抱起来内射丰满少妇视频| 最新国产三级电影在线播放| 91精品国产高清久久久电影| 东北寡妇特级毛片免费| 成人区人妻精品一区二区不卡视频 | 99视频在线观看国产| 成 人片 黄 色 大 片| av综合中文字幕| 解忧午夜少妇翘臀福利视频| 国产又爽又黄游戏视频| a亚洲Va欧美va国产综合 | 97精品免费视频| 国产精品精品国内自产拍| 91精品综合久久久久五月天| 福利午夜春色影视| heyzo中文字幕在线| 96533电视影片免费 | aⅴ在线视频男人的天堂| 成年美女黄网站18禁动态图片| 国产办公室老板AV秘书| 4色视频中文字幕| 18禁无遮挡羞羞污污污污免费| 国产99久久久国产精品毛片| 公车上双乳被老汉揉搓玩弄漫画| 最近中文字幕高清字幕在线视频 | 国产www视频在线播放| 顶级绝伦推理片密桃传媒 | 91精品啪在线观看国产18 | 99久久夜色精品国产| 最新国产三级电影在线播放| 自拍视频在线观看视频精品| 亚洲?v日韩?v高潮无码专区| 潮喷大喷水系列无码精品视频| 丁香婷婷五月情天| 成AV免费大片黄在线观看| 成年人电影免费 | 18以上黄色内射国产影院| 给我免费看播放片| 国产av一区二区三区精华液| 成年人无码三级片视频网| 国产av一区二区三区精华液| 成人18在线视频| 丁香花免费高清视频完整版| av在线天堂网站中文字幕| 变态另类欧美天堂网 | 变态另类欧美天堂网 | 最新日韩欧美中文字幕 | 97无码免费人妻超级碰碰碰| 91成人国产片女人爽到高潮| 成人瑟瑟在线观看| 成在人线av无码免观看麻豆| 2019中文字幕V片在线 | 波多野结衣视频三区 | 欧美日韩国产在线下载| 成熟少妇一区二区| 91精品国产免费久| 成人嘿咻色情一区二区| 99热这里只有精品国产免费免费| 1024手机在线看片日本欧美 | 91精品国产调教在线观看| 亚洲?v日韩?v高潮无码专区| 钢托盘等物流设备 | 够浪的熟妇让你爽视频| 国产a亚洲一区二区| 成人A级情欲片在线观看免费HD| 91精品国产调教在线观看| 俺去也影音先锋播放| 97精品久久久大香线蕉| 1024手机在线看片日本欧美 | 国产成人91一区二区三区APP | 99久久精品国产免费看不卡| 18禁无遮挡羞羞污污污污免费| 波多野结衣av全免费观 | 99精品视频在线观看免费一| 高清完整版在线观看| 成人国产一区二区 | 最近中文字幕高清字幕在线视频 | 91免费国产视频| japanese17一19hd| 按摩师的粗大在我体内进出视频| 东北妇女xx做爰视频 | 91妻人人澡人人爽人人精品| xxx波多野结衣苍井空| 国产www视频在线播放| 成人黄色免费在线播放| 最新国产日韩在线观看网站| 18禁无码永久免费无限制观看| 成 人色 网 站 欧美大片| 国产AV剧情琪琪| 99国产精品视频免费 | 91大香蕉国产一区| caoporn成人免费公开 | 够浪的熟妇让你爽视频| 9191国语精品高清在线最新| 91精品啪在线观看国产18 | 亚洲中文字幕熟女久久| 成人嘿咻色情一区二区| 97国产v欧美 | 99精品国产免费观看| 176精品二区免费视频| 超碰97在线线播放 | www.99热这里只有精品 | 国产精品美女视频| 成人丝袜淫脚在线观看| 精品少妇人妻av免费久久胖妇| 18禁免费视频无遮挡网站| 古装A级野外爱做片视频| 1024手机在线看片日本欧美 | 91av欧美一区二区 | 高清无码黄色三级| av天堂热无码手机版| 波多野结衣无码视频| 日本亚洲免费播放| 99精品国产免费观看| 波多野结衣一本加勒比69| 国产 欧美 日韩在线视频| 自偷精品精品国产日韩| 99久久国产综合精麻豆| xxx.69国产在线观看| 国产激情久久99久久| 91成人精品福利在线播放| 欧美mv日韩mv国产网站app| 大香草久久久久久久国产av| 最近日本韩国免费高清视频| av在线不卡网站无码18禁| 大陆国产精品九九视频网 | 潮喷大喷水系列无码精品视频| 99久久精品免费看国产四区| 91精品啪在线观看国产18 | 94久久精品午夜| 粉嫩国产精品呻吟高潮av| 国产av一区二区三区精华液| 99热99在线视频精品| 国产?V无码日韩毛片| 公和我在野外做好爽爱爱小说雨婷| 久久久久久久岛国综合免费观看 | 99蜜桃臀久久久欧美精品制服丝袜亚洲中文综合 | 97精品人人抽插| 俺去也影音先锋播放| 成人黄色免费在线播放| 农村嫖妓一区二区三区| 成人性生交A片免费看麻豆| 八戒八戒韩国电影百度网盘| 91在线免费观看网站| www.最色网com| 2025最新黄网址大全| 18禁男人用j戳美女免费网站| AV成人无码网站在线观看| 91精品国产高清久久久电影| 99视频在线观看国产| 超碰97在线人人在线| 99热这里只有精品8 | 91在线免费观看网站| 国产精品一区二区无码免费看片| av国产在线天堂| 成3d漫二区三区四区| 91欧美精品成人综合在线| 91美女性爱视频| 国产成人a一片免费看| 国产成人精品18禁| aⅴ在线视频男人的天堂| 在线观看av永久免费| a亚洲Va欧美va国产综合 | 大量国内自拍AV手机观看| 国产日精品久久久久久| 公车上双乳被老汉揉搓玩弄漫画| 99精品国产兔费观看久久99 | 国产99久久久国产精品毛片| 成人午夜AV电影免费观看| 丰满熟女人妻中文字幕免费| 成人性爱网站大全| 超级h的日本动画片| 超碰男人亚洲AV| 成人A级情欲片在线观看免费HD| 古装A级野外爱做片视频| 国产91精品一区二区传媒| xxx.69国产在线观看| 粗大禁伦亲女H顾林晓晓| 第4色影院午夜在线观看| 91人澡人妻人人做人人爽 | www国产精品久久久久久 | 高潮春药失禁按摩精油H| 亚洲A∨无码精品午夜电影| a亚洲Va欧美va国产综合 | 国产 日本 欧美 一区| 亚洲中文字幕熟女久久| 成年A毛片免费观看| 91精品综合久久久久五月天| 成3d漫二区三区四区| 99热在线精品一区二区三区| 成人亚洲日本一区二区三区 | 不卡的神马电影网| 91av欧美一区二区 | 2025最新黄网址大全| 99视频在线观看国产| 返回码: 404 网站打不开 重查| 亚洲精品久久久久AV无码 | 超碰男人亚洲AV| 成人片一级A片免费视频| 爱爱网网站免费观看| 国产又爽又黄游戏视频| 国产?V无码日韩毛片| 国产超薄丝袜在线观看| 020久久国产综合精品swag| 99在线播放视频| 99在线播放视频| 97精品久久久大香线蕉| 5566精品资源在线播放| 超级青草碰碰免费视频| 91免费国产视频| 动漫熟女制服一区二区 | 高潮春药失禁按摩精油H| 自偷精品精品国产日韩| 边做奶水跟着狂喷av| 妇女高潮一区二区三区69 | 一区二区国产盗摄精品| 大学生高潮一级A片视频| 超碰97在线线播放 | 91影音在线观看| 国产av一区二区三区精华液| 57pao久久国产线看观看 | h视频尤物在线一区| av熟女观看一区| 国产精品偷乱一区二区三区| 成人高清精品视频| 八戒八戒www在线视频| 99久久精品精品6精品精品 | 91精品啪在线观看国产18 | 自偷精品精品国产日韩| IPZ041天海翼被犯女教师 | 国产aⅴ精品动漫一区二区| 91成人国产片女人爽到高潮| 高清亚洲精品一区二区三区| 国产人妻精品一二三区| 成人国产精品视频免费| 57pao久久国产线看观看 | 国产成人精品A视频免费福利| 国产精品1区2区3区| 最新中文不卡Aⅴ| av天堂热无码手机版| 大学生高潮一级A片视频| 大肉棒插入阴道视频免费看| 草草福利欧美中文字幕免费 | 91人妻人人澡人人爽人人精品投稿| 最近2018中文字幕免费看手机| 2021国产最新盗摄在线播放| 成人一区二区三区国产| 最新日韩欧美一区二区三区| 成人深夜免费在线视频| 成年女人视频永久免费看| 97久久香蕉国产线看观看| 美女裸体无遮挡免费视频| 91影音在线观看| xxx波多野结衣苍井空| 1024手机在线看片日本欧美 | 成人午夜网址免费毛片| 成人14欧美片免费| 高清日本在线观看国产| 国99精品无码一区二区三区| 成人福利在线视频| 97人妻成人免费视频| 4色视频中文字幕| 抱起来内射丰满少妇视频| 91视频720 | 69精品国产高清一区二区三区| A一区二区三区乱码在线 | 国产AV国片精品有毛| 2025最新黄网址大全| 国产A级毛片视频| 东京不热视频在线播放| av国产在线天堂| 97精品免费视频| av一区二区黄片| 丁香六月伊人啪啪综合网 | AV每日更新在线观看| 99爱在线欧美日韩第二页| 囯产亚州中文字幕日韩在线| av手机在线观看一区二区三区| 高清三级精品国产| www日本一区二区三级电影| 91高清综合一区天天干夜夜操| 成人在线播放欧美日韩 | 丰满人妻无奈张开双腿AV| 98国产成人综合久久精品| 6080亚洲理论片在线观看| 苍井空bt种子下载| 69精品人妻一区二区三区蜜桃 | 成人国产99视频在线观看 | 成人国产三级视频在线观看| 少一女乱一交一精一品| 2020人妻中文字幕在线乱码| 69精品人妻一区二区三区蜜桃 | 91欧美日韩在线一区二区| 99久久国产综合精品1 | 高清在线不卡国产| 成人特级裸体AAA毛片 | 3d肉浦团在线观看| japanese久久中文字幕 | av在线1区2区| 成 人 A V 在 线 免 费 看| 91州精品一区二区三区| 高清不卡一区二区三区| 国产成人se在线播放| 给我播放片在线观看8集免费| 2017秋霞在线观看免费大奶子 | 99久久国产综合精品1 | 成人无码H在线网站超大尺度| 国产黄色A级故事言情中文字幕| 91社区人妻精品| aV影音先锋毛片子| aa福利亚洲国内在线精品| 91州精品一区二区三区| 波多野结衣aⅴ免费视频| 中文精品一区二区三区四区无码视频| 91午夜日韩在线观看免费| 成人午夜性A级毛片免费| 91日韩欧美综合 | 91精品高清无码 | 最新日韩三级视频| 91午夜日韩在线观看免费| AV国産精品毛片一区二区三区| 18禁黄黄美女网站在线看| 99爱在线欧美日韩第二页| 99re这里只有国产中文精品国产精品| 99爱在线欧美日韩第二页| 国产欧美亚洲一区二区精品| 国产超级a天堂直播在线观看| 最新最热中文字幕在线观看| 综合亚洲图片一区在线| 草莓成人app下载| 苍井空巨乳教师线观看| 国产成人av免费在线播放| 99爱在线精品免费观看| 福利一区三区国产在线视频| 高清国产在线看片| cc中文字幕日本欧美xu | 91视频精品在线观看 | av资源在线永久免费观看| 初高中生精品福利视频| 丰满人妻无奈张开双腿AV| 成人免费视频免费看www毛片| 给我播放片在线观看8集免费| 把腿张开我会让你很爽的 | 91tv官网精品成人亚洲| 515欧美老妇人| 91社区人妻精品| 最新亚洲无码不卡视频网站 | www.亚洲国产| 91在线视频免费91 | 久久国产精品www| 1区2区3区4区产品乱码芒果| 成人免费视频免费看www毛片| 91av一区二区三区| 波多野中文字幕一区免费| 99久久国产综合亚洲区| 国产av午夜精品一区二区三区| 成人黄片av在线免费观看| 草莓视频高清在线观看| 成AV人片在线观看| 91免费国产精品| 最新中文字幕av无码专区引| а√天堂中文在线官网| 国产AⅤ精品一区二区果冻| 2020日韩在中文字幕在线| 99999久久久久9国产精品| av资源在线永久免费观看| 国产v日韩v欧美v不卡 | 欧美日韩精品| xxxx18一20岁hd第一次 | 91短视频版在线观看| 高清国产在线看片| 成年人小黄片毛片免费在线观看| 99精品福利视频| 欧美片《肉欲进入》| 91社区男人电影影院| av大片免费完整版| 99激情视频盗拍这里免费| k频道日韩欧美精品| 91视频一区免费| 成人无码一区二区三| av黄在线观看j| 亚洲大片免费观看视频| bt天堂在线最新版官网 | 99激情视频盗拍这里免费| 国产+日韩+欧美高清视频| 三级黄色精品一区二区| 最新国产一区最新在线| 丁香婷婷激情久久| 91视频精品在线观看 | 国产∨亚洲∨天堂无码久久| 69精品人妻一区二区三区蜜桃 | 波多野结衣aⅴ免费视频| 国产av午夜精品一区二区三区| 91av一区二区三区| 高级会所人妻互换94部分 | 国产强被迫伦姧在线观| 97色伦午夜国产亚洲精品 | 国产av一区二区色密| 97色伦午夜国产亚洲精品 | 最新不卡中文av在线播放| 99热国产这里只有精品无卡顿| 国产成人se在线播放| 91精品啪在线观看国产18 | 草莓影视网站在线观看| 国产AⅤ精品一区二区果冻| 国产黄色A级故事言情中文字幕| 高潮抽搐在线观看五月丁香激情视频 | 粉嫩AV久久一区二区三区| а√天堂中文在线官网| 草莓视频入口在线网站| av手机在线观看一区二区三区| 二区不卡的av在线播放| 97在线看视频完整版| 成 人 动漫在线观看网站| 成人免费高清视频一个人www| 91精品国产欧美一区二| 国产成人黄色视频| av线上免费观看| 7777色鬼XXXX欧美色妇 | 国产成a人亚洲精品在线观看| vr高清亚洲精品二区| japanese久久中文字幕 | 成人国产三级在线| 亚洲午夜精品小说图片专区| 99爱在线精品免费观看| www天堂资源在线| 最新中文字幕av无码专区引| yy22tv夜月| 成年美女黄网站色大片免费看 | 97在线看午夜福利| 国语自产拍91在线网站| 91州精品一区二区三区| 大家可以在这里91在线视频免费| 99麻豆久久久国产精品免费| 多毛的大隂户撒尿特写| 国产v日韩v欧美v不卡 | 亚洲国产精品久久久久爰色欲| 国产成人禁片在线观看| 国产va免费精品观看精品黄片 | 成全动漫视频在线观看| 成人女人A级毛片免费一 | av毛片免费久久久久性活 | 白嫩少妇激情无码| 92少妇午夜福利视频在线| 成 人 动漫在线观看网站| 91av欧美一区二区 | 亚洲春色在线播放| 69麻豆天美精东蜜桃传媒潘甜甜 | 91丝袜国产欧美| 非洲黑人三级全黄| 91在线精品观看网| 浮力影院最新发地布地扯| 5566中文字幕永久| 草莓视频下载app污| 丰满少妇高潮惨叫久久久一| 久久夜色精品国产亚洲噜噜 | 6080亚洲精品一区| 国产成人精品不卡av| 大陆久久久久久久免费视频| 高端会所少妇人妻在线电影 | 成AV人片在线观看| 成人在线国产日韩| av毛片免费久久久久性活 | 国产91在线你懂的精品| 91一级特黄大片 | 91精品国产在线伊人 | 丁香婷婷激情久久| 亚洲日韩国产AV无码无码精品| 91欧美日韩在线一区二区| aa级毛片在线免费观看| 9l国产精品久久久久| 高清不卡一区二区三区| av色国产精品喷浆| 亚洲大片免费观看视频| 成人午夜性A级毛片免费| 国产成a人亚洲精品在线观看| 337p欧美日本久久久| 91视频一区免费| 国产A级毛片视频| 国产swag无套剧情在线观看| 最新国产精品V在线播放观看不卡| 久久夜色精品国产亚洲噜噜 | 成视频年人黄网站免费视频| 丰满老熟女白浆直流| 国产成人av在线影院 | 97久久超碰中文字幕| 国产成人盗摄在线视频| 亚洲高清无码不卡在线视频| 二三四五六七无产乱码 | www.亚洲国产| 337p欧美日本久久久| 91精品高清无码 | 国产成人精品不卡av| cc中文字幕日本欧美xu | 91av欧美一区二区 | 97热久久免费频精品99| 97色伦午夜国产亚洲精品 | 丰满少妇尤物精品一区二区| 成人黄色视频91| mature熟女老熟妇| 国产a级毛片久久久精品毛片 | 91社区男人电影影院| 99麻豆久久久国产精品免费| 白丝护士小仙女自慰喷白浆| 91亚洲欧美国产制服动漫| sis无码视频j精品| 最近更新中文字幕7| 91av一区二区三区| AV国産精品毛片一区二区三区| 国产成a人亚洲精v| 成人免费一区二区三区动漫| 国产超级a天堂直播在线观看| mm131午夜爽爽爽免费视频| 97人妻人人做人人爱| 成年女人喷潮毛片免| 97人妻人人做人人爱| 国产成人se在线播放| 男女猛烈无遮掩国产精品一区| 最新亚洲无码不卡视频网站 | 成人黄片av在线免费观看| 成人亚洲欧美成ΑⅤ人在线观看| www9999cm| av国内精品久久久久影院| aⅴ亚洲av综合在线观看| 精品无码国产一区二区深花| 91州精品一区二区三区| 日本亚洲免费播放| 二区不卡的av在线播放| 成人短视频app| 国产91精品一区二区传媒| 99久久国产综合精品女图片| 91州精品一区二区三区| 国产91 眼镜对白在线播放| 69SEX久久精品国产麻豆| k频道日韩欧美精品| 高清国产摸出水在线视频| 丁香六月婷婷好开心欧美| 成人亚洲色欲色一欲WWW| 337p日本欧洲亚洲大胆精品555588| vip国产精品视频免费观看| 丰满少妇高潮惨叫久久久一| 97精品伊人久久久大香线蕉 | 99久久国产综合精品女图片| 豆国产96在线 | 99国产成人精品av电影| 草莓视频高清在线观看| 欧美日韩精品| 甘露寺×小芭内肉本| pans福利模特私拍网| 成人免费一区二区三区视频软件 | 久久无码一区二区三区少妇 | av成人午夜无码一区二区| 把腿张开我会让你很爽的 | 最新网站亚洲人成无码| 91久久香蕉青青草原娱乐 | 97在线看午夜福利| 91九色李宗瑞在线观看| 国产A级毛片视频| 97无码人妻福利免费公开在线视频| 91一级特黄大片 | 最近2019中文字幕日韩| 99成人精品视频在线观看婷婷 | 最近2019中文字幕日韩| 99热这里只有精品免费国产 | 2017秋霞在线观看免费大奶子 | 草莓视频未满十八勿网站| 大陆久久久久久久免费视频| aⅴ亚洲av综合在线观看| 成人精品一区日本无码网站| 最近2019年中文字幕一页| 国产a级毛片久久久精品毛片 | 免费精品国自产拍在线播放| 国产成人av在线影院 | 成人无码H在线网站超大尺度| 成人福利视频在线观看| 国产∨亚洲∨天堂无码久久| 国产av午夜精品一区二区三区| 6080亚洲理论片在线观看| 高潮痉挛大喷水在线观看| 91亚洲欧美国产制服动漫| 国产a国产片国产| heyzo无码综合国产精品| 亚洲国产精品久久久久爰色欲| 国产成人A亚洲精V品无码| 成年女人午夜毛片免费视频| 7777色鬼XXXX欧美色妇 | japanese久久中文字幕 | 不卡高清中文字幕在线播放| av熟女麻豆中文字幕| k频道日韩欧美精品| 99九九在线免费视频2018| JK制服女仆高潮喷水流白浆| 最新在线观看国产小视频 | 亚洲日韩国产AV无码无码精品| 凹凸福利导航视频| 2017秋霞在线观看免费大奶子 | 成人av一区在线观看| 国语自产拍91在线网站| 扒开老女人毛茸茸的黑森林| 91在线视频免费91 | 国产成人禁片在线观看| japanese久久中文字幕 | 当众高潮潮喷羞耻耻辱调教| 91精品视频免费在线观看观看| av片在线看一区二区| 91精品啪在线观看国产18 | av国内精品久久久久影院| 1区2区3区4区产品乱码芒果| 成人在线播放欧美日韩 | 18国产精品白浆在线观看免费 | 成人黄片毛片免费在线观看| 国产超级a天堂直播在线观看| 苍井空bt种子下载| 成人在线观看电影| 超级乱婬刺激视频网站 | 成人男女男女激情A片| 主页亚洲视频专区| 白洁少妇全文无删减在线阅读| 成人av一区在线观看| 囯产亚州中文字幕日韩在线| 国产69精品久久久久99尤物| 91久久成人18免费网站| 成人瑟瑟在线观看 | 高中最新最全免费在线看黄片| 久久无码一区二区三区少妇 | 草莓成人app下载| 给我播放片在线观看8集免费| 苍井空qvod在线| 91av欧美一区二区 | 扒开老女人毛茸茸的黑森林| 成年人免费看二区三区视频| 大尺度美女在线观看| 69麻豆天美精东蜜桃传媒潘甜甜 | 中文字幕人妻在线一区| 亚洲精品无码在线观看福利姬| 国产AV无码专区亚洲AV软件| 波多野吉AV无码AV乱码在线| 高潮痉挛大喷水在线观看| av线上免费观看| 综合欧美久久三级| 成年美女黄网站色大片免费看 | 99爱在线欧美日韩第二页| cc中文字幕日本欧美xu | 成全动漫视频在线观看| 99美女精品高潮视频免费| 国产3p一区二区三区| 日韩激情无码| 91州精品一区二区三区| av黄在线观看j| 国产成a人亚洲精品在线观看| 亚洲欧洲日产国码中学| av成人午夜无码一区二区| 国产3p一区二区三区| 岛国av免费无码网站| 91性爱视频在线观看 | www9999cm| 最近2019中文字幕日韩| 3d玉蒲团在线观看| 最新国产一区最新在线| 国产成人av在线影院 | 国语自产拍91在线网站| 国产美女裸体黄污网站免费观看| 苍井空qvod在线| 国产强被迫伦姧在线观| Xvideos精品国产| 最近中文字幕完整版HD | 99热国产综合精品免费| 成人免费视频免费看www毛片| www9999cm| 亚洲AV无码乱码在线观看性色扶| 成人av免费高清在线播放| 91午夜日韩在线观看免费| 97精品伊人久久久大香线蕉 | 92少妇午夜福利视频在线| www.亚洲国产| 国产AV无码专区亚洲AV软件| av性天堂在线观看| 91亚洲欧美国产制服动漫| 成人亚洲国产综合精品| 自拍偷拍亚洲欧美日韩| 成人无码www免费视频网站软件| 亚洲精品电影天堂网| 苍井空巨乳教师线观看| 最新中文字幕av无码专区引| AV国産精品毛片一区二区三区| 成人黄片av在线免费观看| 国产成A人亚洲精V品无码 | 精品爆乳一区二区三区无码AV| 成年人免费看二区三区视频| 91社区男人电影影院| 99精品國產成人一區二區 | 91av欧美一区二区 | 91社区人妻精品| 2025av在线| 成人福利国产视频| www.亚洲国产| 亚洲秘无码一区二区三区电影| 91会所技师口爆在线播放| 男女猛烈无遮掩国产精品一区| 福利片高清视频一区免费| 国产99最新在线网址| a∨潮喷大喷水系列无码番号| 丰满少妇高潮惨叫久久久一| 91会所技师口爆在线播放| 三级黄色精品一区二区| AV天堂久久天堂色综合 | а√天堂中文在线官网| 91免费国产精品| 亚洲秘无码一区二区三区电影| 大腿叉开见b动态图| 99re这里只有国产中文精品国产精品| 最新国产中文字幕在线观看| 91日韩高清国产在线pron| k频道日韩欧美精品| heyzo无码综合国产精品| JK制服女仆高潮喷水流白浆| 成人特级裸体AAA毛片 | 成人av一区在线观看| 国产成人av免费在线播放| 91精品国产91久久久久粉嫩| bt天堂网www天堂| 浮力影院最新发地布地扯| 成人国产三级在线| 国产gay高中生小鲜肉屁股| 亚洲秘无码一区二区三区电影| av手机在线观看一区二区三区| 丰满人妻无奈张开双腿AV| av片在线播放 | 综合5月色婷婷一区二区三区| av国内精品久久久久影院| 产福利一区在线观看精品尤物| av片免费播放在线观看| 成人18在线视频| 国产91色在线观看 | 99爱在线欧美日韩第二页| 2019国产在线| 国产jk福利在线| 丰满少妇高潮惨叫久久久一| 9l国产精品久久久久| av三级国产三级在线观看 | 高清不卡一区二区三区| 国产69精品久久久久99尤物| 国产乱子伦视频大全| 二区中文字幕在线| 高清不卡一区二区三区| 丁香婷婷激情久久| 成人特级裸体AAA毛片 | 久久国产精品www| 337p美女在线视频| 草莓视频高清在线观看| 成人爽a毛片免费| 最近日本电影影视在线观看免费| 7777色鬼XXXX欧美色妇 | 高中最新最全免费在线看黄片| 亚洲专区高清无码| 91社区人妻精品| 91精品视频免费在线观看观看| 成人免费高清视频一个人www| 超碰国产精品第一页97| 被公侵犯强压中文字幕| 国产av一区二区色密| 白嫩少妇激情无码| 18国产精品白浆在线观看免费 | 草莓视频入口在线网站| 丰满熟妇人妻中文字幕| 99热国产综合精品免费| 成人男女男女激情A片| 丰满少妇尤物精品一区二区| 99热这里只有精品66| 男女猛烈无遮掩国产精品一区| 99一区二区三区| 最新在线观看国产小视频 | 中文字幕在线亚洲2018| 插逼强奸视频中文字幕| 91精品国产欧美一区二| www9999cm| 成人男女男女激情A片| 国产美女裸体黄污网站免费观看| 精品无码国产一区二区深花| 91短视频版在线观看| 又黄又刺激超爽动态图| 最近中文字幕高清字幕视频| av在线1区2区| 亚洲高清无码不卡在线视频| 国产91色在线观看 | 99re66热这里只有精品4| 丰满少妇高潮惨叫久久久一| 最新网站亚洲人成无码| 91色在线观看国产| 冲田杏梨种子连接| 91久久香蕉青青草原娱乐 | 99精品视频观看| 国产69精品久久久久99尤物| 99re66热这里只有精品4| 八戒八戒免费视频| 国产成人精品不卡av| 波多野中文字幕一区免费| 91手机视频在线| 日本私人一二三四区色欲| 国产AV国片精品有毛| 成人黄色网站视频色 | 福利一区三区国产在线视频| 最近日本电影影视在线观看免费| 东北妇女xx做爰视频 | 99久久久无码国产精品9| 99九九在线免费视频2018| xxx国产日本免费观看| 91精品高清无码 | av一区二区黄片| 国产在线精品免费91| 999亚洲精品无码久久久久| 1区2区3区4区产品乱码芒果| 国产成人se在线播放| k频道日韩欧美精品| 亚洲精品电影天堂网| 国产成人黄色视频| 成人毛片视频看看| 放荡人妻少妇中文字幕91| 91tv官网精品成人亚洲| 91在线精品亚洲第一区香蕉| 草莓视频下载app污| 99re66热这里只有精品4| 91久久精品磁力| 国产农村妇女一二三毛片| 91av一区二区三区| 99999久久久久9国产精品| 少一女乱一交一精一品| 大尺度美女在线观看| free性欧美人与doog| 国产91美女视频一区二区 | 99久久国产综合精品女图片| 亚洲高清无码不卡在线视频| 91精品国产九九九久久久亚洲| 99久久精品少妇高潮喷水| 丁香六月伊人啪啪综合网 | 成 人 A V 在 线 免 费 看| 久久精品激情综合网| 国产超碰女人任你爽| 第九色区AV天堂| 成人性生交A片免费看麻豆| 99午夜啪啪日本熟妇乱子ä片| 91美女性爱视频| 啊级免费黄片视频| 东京热加勒比hezyo一道高清| 成人国产精品视频免费| 苍井空免费线在线观看| 18禁黄网站无码无遮挡| 床震奶头好大揉着好爽视频| 爱爱网网站免费观看| 最新中文不卡Aⅴ| ?愛妃?国产青草视频免费观看| 丁香婷婷激情久久| 国产精品美女视频| aⅴ在线视频男人的天堂| 百度国产精品网友自拍| 动漫人物打扑克剧烈运动软件下载| 成人国产精品视频免费| AV成人无码网站在线观看| 99久久夜色精品国产| 朝鲜女人大白屁股ass| 2021国产最新盗摄在线播放| 91国产偷拍自拍| 成人日韩欧美视频在线观看| 少妇中文综合欧美| 成人丝袜淫脚在线观看| 波多野结衣一区二区三区| 操老熟女熟妇免费视频| 成在人线av无码免观看麻豆| 丁香花免费高清视频完整版| 亚洲熟女乱综合一区二区三区| 东京热加勒比hezyo一道高清| 成版人one一个app| 2019中文字幕V片在线 | 91高清视频国产片| 闺蜜们的放荡交换系列| 国产成人精品A视频免费福利| 成人18在线视频| 亚洲中文字幕熟女久久| 成人18在线视频| 51avi在线视频| 国产1024看片在线| 成人午夜有码一区二区 | h视频尤物在线一区| xxx波多野结衣苍井空| 51大豆行情网站仙踪林| 国产日精品久久久久久| ?愛妃?国产青草视频免费观看| h视频尤物在线一区| 东京热加勒比hezyo一道高清| 日本中文字幕乱码在线| 99精品国产免费观看| 成人免费乱码大片A毛片| 91av欧美一区二区 | 18禁无遮挡羞羞污污污污免费| 超碰97在线线播放 | 57pao久久国产线看观看 | 1024手机在线看片日本欧美 | 2019中文字幕V片在线 | 亚洲中文字幕无码一区红杏av| 91视频黄色免费| 八戒八戒免费视频| 精品少妇人妻av免费久久胖妇| 成人国产一区二区 | 18禁无遮挡羞羞污污污污免费| 99国产成人精品av电影| 国产AV无码专区亚洲AV琪琪| 亚洲无码在线视频观看| 91妻人人澡人人爽人人精品| 51精品久久亚洲中文无码| 69视频成人免费看 | 99无码精品热在线观看| 97精品久久久大香线蕉| 高潮春药失禁按摩精油H| 99视频在线观看国产| 4438毛片视频网站| 在线播放中文无码AV有码| 白丝jk网站国产免费| 成人精品午夜久久| 宝贝~好爽~好硬~好紧~视频| 91久久香蕉国产熟女线 | 亚洲无码在线视频观看| 成人大片视频免费在线观看| 国产av一区二区三区精华液| 草莓视频在线观看免费精品 | 337p欧美日本超大胆艺术| 97碰碰人妻无码视频免费| 精品少妇人妻av免费久久胖妇| 成人14欧美片免费| 高清毛片无遮挡免费视频| 波多野结衣家庭教师| 97精品久久久大香线蕉| 斑马视频电影免费观看| 国产人妻精品一二三区| 国产AV国片精品有毛| 高清国产在线看片| 最新免费大片a∨手机看片不卡 | 8050午夜二级毛片免费 | 超级h的日本动画片| 百度国产精品网友自拍| 18禁无码永久免费无限制观看| 成人黄色在线网站| A一区二区三区乱码在线 | 大香草久久久久久久国产av| 超碰中文字幕久久精品| 96533电视影片免费 | 一级婬片AAAAAAA密柚| XXX少妇厨房XXX乱| 成人亚洲日本一区二区三区 | 91麻豆精品欧美一区二区| 69精品久久久久人妻| 波多野结衣一区二区三区| 成人午夜网址免费毛片| www国产精品久久久久久 | 91美女性爱视频| 最新欧美18∨ideosex性欧美| 3d肉蒲团电影下载| 成人嘿咻色情一区二区| 日本中文字幕乱码在线| 一级婬片AAAAAAA密柚| 国产?V无码日韩毛片| 成人性爱网站大全| 99国产成人精品在线观看| 97国产v欧美 | 91欧美日韩在线一区二区| 成人精品久久国产av| 91精品国产调教在线观看| 99视频在线观看国产| 2025最新黄网址大全| 99久久精品国产免费看不卡| 国产精品精品国内自产拍| 欧美日本亚洲人妻中文字幕 | 2019中文字幕V片在线 | 大量国内自拍AV手机观看| 97无码免费人妻超级碰碰碰| gogogo视频在线观看| 2021国产最新盗摄在线播放| yw最新日韩精品中文字幕一区| 91久久香蕉国产熟女线 | 福利视频导航在线| 97国产线视频在线观看 | 国产SUV精品201| 成人性生交大片免费看试看| 高清欧美日韩中文字幕 | 99热99在线视频精品| 国产成人a一片免费看| av中文字幕亚洲精品| 国产成人91一区二区三区APP | 成人自拍网站在线观看| 丁香花免费高清视频完整版| 成年午夜无码AV片在线观看| 国产SUV精品201| www.亚洲中文字幕在线观看 | 最近2018中文字幕免费看手机| 欧美精品玖玖玖在线靠爱| 成人18在线视频| 百度国产精品网友自拍| 变态另类欧美天堂网 | caoporn成人免费公开 | 成人片毛片AAA片免费| 成人免费毛片视频APP| 99日本人妻视频| 成人久久国产精品毛片| 波多野洁衣作品名字| 福利视频导航在线| 大肉大捧一进一出| 国产成人精品A视频免费福利| **毛片播九公社| 91视频91视频| 99精品国产兔费观看久久99 | a网站在线观看片源丰富、内容全面| 成人国产一区二区 | brazzershd欧美巨大| 成AV免费大片黄在线观看| 解忧午夜少妇翘臀福利视频| 最近日本韩国免费高清视频| 高清成年美女xx网站黄| 边吃奶边添下面好爽| 17c国产精品88888| 51avi在线视频| 国产成年无码AU在线观看 | 波多野结衣家庭教师| 94久久精品午夜| 大帝a∨无码视频在线播放 | 91尤物在线观看精品| brazzershd欧美巨大| 成年人在线观看视频| 成人天堂入口网站| 国产av巨作一区二区三区| 成人三级免费视频| 亚洲中文字幕无码一区红杏av| 176精品二区免费视频| 公和我在野外做好爽爱爱小说雨婷| 百度国产精品网友自拍| 最新在线观看国产小视频| 各种少妇BBW撒尿| 中文人妻熟妇乱又伦精品| 不卡在线免费播放 | 国产成人a一片免费看| 成在人线av无码免观看麻豆| 高清偷自拍亚洲精品三区 | 第九理论午夜电影院| 91尤物精品福利视频| 97夜夜澡人人爽人人喊免费阅读 | 日本亚洲免费播放| 高清无码黄色三级| 27XXOO动态图178期试看| 丁香婷婷五月情天| gogogo免费高清看中国国语| 成年人免费在线观看视频的视频| 国产乱子伦无码视频免费| 2021久久黄色大片| 2023老司国产精品免费视频| 抱起来内射丰满少妇视频| 成人深夜免费在线视频| 成人午夜特黄AA片男| 69视频成人免费看 | 日日碰夜夜添天天爽无码一区| 799999色色色色色44444 毛片| 草草福利欧美中文字幕免费 | 国产成人精品18禁| 国产AV剧情琪琪| 伴郎粗大的内捧猛烈进出视频观看| 亚洲熟女乱综合一区二区三区| 粉嫩国产精品呻吟高潮av| 99精品国产兔费观看久久99 | 欧美日本一区二区三四区| 国99精品无码一区二区三区| 成人福利在线视频| 超清乱人伦中文视频| 成人福利在线视频| heyzo中文字幕在线| 成年美女少妇看黄片 | 八戒八戒免费视频| 97久久香蕉国产线看观看| 5566精品资源在线播放| 91香蕉视频最新版| 91尤物精品福利视频| 91麻豆国产一级毛片| 动漫熟女制服一区二区 | 15yc午夜在福利在线观看| 69精品国产高清一区二区三区| 17岁中国高清免费完整版| 最新高清无码专区 | 成人久久国产精品毛片| 国产吧在线观看视频论坛 | 99视频内射三四 | caoporn成人免费公开 | 15yc午夜在福利在线观看| 成人拍拍拍拍在线观看| 97无码精品人妻免费一区二区 | 成人免费毛片视频APP| 国产成人精品A视频免费福利| 15yc午夜在福利在线观看| 97无码精品人妻免费一区二区 | 丰满女邻居的嫩苞张开| 国产免费成人久久综合一区| 成人片一级A片免费视频| 草莓视频ios下载视频观看| 9191国语精品高清在线最新| av天堂热无码手机版| yyyy11111少妇无码影院| 18禁裸体私密部位无遮挡| 99日韩精品视频| 成人性生交大片免费看试看| 91精品国产高清久久久电影| a网站在线观看片源丰富、内容全面| 成年午夜无码AV片在线观看| 成人影视一区二区| 亚洲?v日韩?v高潮无码专区| 高清成年美女xx网站黄| 99日韩精品视频| 国产精品偷乱一区二区三区| 高清完整版在线观看| 91大神精品伊人| 成人免费无码大片a毛片| 成人影视一区二区| 八戒八戒韩国电影百度网盘| 最新亚洲人成无码网WWW电影| 公和我在野外做好爽爱爱小说雨婷| a a毛片免费在线播放| 91视频720 | 成人一区二区三区国产| 9色精品在线观看| 成人黄色免费在线播放| 91夜夜人人揉人人捏人人添| av免费在线观看香蕉 | 第4色影院午夜在线观看| 宝贝打开点我要尿里面h | 成人国产精品视频免费| 伴郎粗大的内捧猛烈进出第一章| 成人性生交大片免费看试看| 国产av巨作一区二区三区| 成人性生交大片免费看试看| 大量国内自拍AV手机观看| 最近2018中文字幕免费看手机| 被水电工侵犯的人妻在线| 伴郎粗大的内捧猛烈进出第一章| 18禁裸体私密部位无遮挡| www.99热这里只有精品 | 返回码: 404 网站打不开 重查| 东京不热视频在线播放| 粉嫩国产精品呻吟高潮av| 97无码精品人妻免费一区二区 | 抱起来内射丰满少妇视频| 18禁午夜免费福利久久| 99久久精品精品6精品精品 | 成人区人妻精品一区二区不卡视频 | av综合中文字幕| 91麻豆产精品久久久久久粉嫩| 超碰在线播放97 | 精品少妇人妻av免费久久胖妇| 波多野结衣一区二区三区| 2025最新黄网址大全| 799999色色色色色44444 毛片| 成全免费观看在线播放| www.最色网com| 91人澡人妻人人做人人爽 | 打扑克牌又疼又叫视频软件| yyyy11111少妇无码影院| 91欧美精品成人综合在线| 成人午夜大片免费看热热色| 国产精品一区二区无码免费看片| 丰满熟女人妻中文字幕免费| 18禁裸体私密部位无遮挡| 国产成人91一区二区三区APP | av在线天堂网站中文字幕| 欧美日韩亚洲精品中文字幕在线观看| 97久久香蕉国产线看观看| 国产成年无码AU在线观看 | 大量国内自拍AV手机观看| xxx波多野结衣苍井空| 伴郎粗大的内捧猛烈进出视频观看| av无码在线播放| 中文字幕在线高清免费不卡| 成人免费无码大片a毛片| 波多野结衣av全免费观 | 国产69精品久久久久久久久久久久 | IPZ041天海翼被犯女教师 | A级毛片内射免费视频| 91香蕉福利一区二区三区| 99精品国产免费观看| AV成人无码网站在线观看| 最新电影在线观看| 伴郎粗大的内捧猛烈进出第一章| 91尤物在线观看精品| heyzo色综合中文字幕无码| 波多野结衣视频三区 | 69精品丰满人妻无码视频A片 | 大学生无套带白浆嗯啊| a a毛片免费在线播放| 国产a亚洲一区二区| 波多野结衣视频三区 | 波多野结衣一区二区三区AV高清| Jizz国产色系免费 | 799999色色色色色44444 毛片| 2025av在线| 92福利电影麻豆| 中文人妻熟妇乱又伦精品| 91尤物在线观看精品| 明明在线观看一区二区三区| 顶级绝伦推理片密桃传媒 | 18以上黄色内射国产影院| av熟女观看一区| 99久久国产综合精品2020| 够浪的熟妇让你爽视频| 国产SUV精品201| 99精品视频在线观看免费一| 176精品二区免费视频| 99精品国产免费观看| 97精品久久久大香线蕉| 国产A级毛片视频| 日本强奷中文字幕在线播放| caoporn成人免费公开 | 高清三级精品国产 | 97精品免费视频| 91日韩欧美综合 | 91妻人人澡人人爽人人精品| 8050午夜二级毛片免费 | A级毛片内射免费视频| 波多野结衣无码视频| wwwav78tv | 波多野结衣一区二区三区AV高清| 69无码人妻互换A片| 成熟少妇一区二区| 91精品高清91久久久久久| 99日本人妻视频| 国产aⅴ精品动漫一区二区| yellow视频中文字幕| 成3d漫二区三区四区| 大学生无套带白浆嗯啊| 超级h的日本动画片| 白丝jk网站国产免费| 91精品国产高清久久久电影| 国产乱子伦无码视频免费| 91天堂第一在线播放| 最新亚洲人成无码网WWW电影| 18禁黄网站无码无遮挡| 大量国内自拍AV手机观看| 最新在线观看国产小视频| 97精品免费视频| avast免费版| XXX一区二日本视频| 91无码人妻精品国产色情竹菊影视| 囯产av无码片毛片一级软件下载 | av熟女观看一区| yellow视频中文字幕| 国产AV剧情琪琪| 97人妻起碰免费公开| 俺去也影音先锋播放| av一级少妇免费看大片| 超碰97在线线播放 | 超碰在线播放97 | 高清国产在线看片| 高清毛片无遮挡免费视频| 337p欧美日本超大胆艺术| 9191国语精品高清在线最新| heyzo色综合中文字幕无码| 91免费国产视频| 国产AV天堂无码一区二区三区 | 欧美mv日韩mv国产网站app| 丰满的人妻hd高清完整版| 国产69精品久久久久久久久久久久 | 第九理论午夜电影院| www国产精品久久久久久 | 国产av毛片一区二区 | 91精品久久久久久久久青青| 欧美肉体视频一进一出在线| 高清欧美日韩中文字幕 | av在线国产一区二区三区| 丰满的人妻hd高清完整版| 成人主播在线精品| 1024手机在线看片日本欧美 | 国产成人91一区二区三区APP | 3d肉蒲团电影下载| 国99精品无码一区二区三区| yyyy11111少妇无码影院| 高清偷自拍亚洲精品三区 | 18禁免费视频无遮挡网站| 高清亚洲精品一区二区三区| 91精品国产调教在线观看| 大香蕉在线综合在线观看| 俄罗斯一级a大片免费| 日日噜噜夜夜狠狠视A片| 成人主播在线精品| 97久久香蕉国产线看观看| 成人黄片av在线免费观看| 成人午夜有码一区二区 | 成人性爱网站大全| 69精品国产高清一区二区三区| 高清无码黄色三级| 成年人电影免费 | 91精品综合久久久久五月天| xxx.69国产在线观看| 99热在线精品一区二区三区| 大学生高潮一级A片视频| 成人丁香在线电影| 99午夜啪啪日本熟妇乱子ä片| 97无码免费人妻超级碰碰碰| 最新高清无码专区 | 成人亚洲日本一区二区三区 | 91国产偷拍自拍| 成人区人妻精品一区二区不卡视频 | 国产成人精品A视频免费福利| 18禁黄网站无码无遮挡| 成人黄色在线网站| wwwav78tv | 不卡的神马电影网| 91人妻人人澡人人爽人人精品投稿| 波多野结衣av全免费观 | 成年人在线观看视频| 在线观看av永久免费| 最近2018中文字幕免费看手机| h视频尤物在线一区| 91妻人人澡人人爽人人精品| 99视频内射三四 | www.亚洲中文字幕在线观看 | 成人亚洲日本一区二区三区 | 成 人片 黄 色 大 片| 91欧美日韩在线一区二区| a亚洲Va欧美va国产综合 | 成人影视一区二区| 91视频720 | 成在人线av无码免观看麻豆| 2025年3月里番| 91在线精品高清免费观看| 丰满的人妻hd高清完整版| 国产AV天堂无码一区二区三区 | 91精品成人国产在线不卡| 97在线视频观看成人| 99日韩精品视频| 波多野结衣+蜜臀| av国产在线天堂| 9热在线视频在线观看免费| 97精品伊人久久久大香线蕉| av中文字幕亚洲精品| 不带套绝色中出中文无码| 99久久国产综合精品2020| 91情侣在线情品国产| 国产?V无码日韩毛片| heyzo中文字幕在线| yellow视频中文字幕| 成版人one一个app| 边做奶水跟着狂喷av| 69精品免费视频| 成在线人AV免费无码高潮喷水 | 在线观看av永久免费| 97夜夜澡人人爽人人喊免费阅读 | 啊级免费黄片视频| 成3d漫二区三区四区| 国产A级毛片视频| 高清三级精品国产 | 2021久久黄色大片| 成人A级情欲片在线观看免费HD| 1024手机在线看片日本欧美 | 久久久久久久岛国综合免费观看 | 丰满少妇一区二区三区在线| 国产91美女视频一区二区 | 一级婬片AAAAAAA密柚| 成年人在线观看视频 | 2019中文字幕V片在线 | 成年午夜无码AV片在线观看| 91香蕉视频最新版| 波多野结衣无码视频| 国产av安全访问午夜福利| 宝贝打开点我要尿里面h | 91免费国产视频| 成年美女网站色在线看免费| wwwav78tv | 第九理论午夜电影院| 成人性爱网站大全| 高清亚洲精品一区二区三区| 国产 欧美 日韩在线视频| 亚洲?v日韩?v高潮无码专区| 国产AV天堂无码一区二区三区 | 高清日本在线观看国产| 欧美日韩亚洲精品中文字幕在线观看| 成人性爱网站大全| 成年A毛片免费观看| 啊级免费黄片视频| 成人一区二区三区国产| 扒开女人内裤猛进猛出免费视频 | av在线不卡网站无码18禁| 最新日韩欧美一区二区三区| 99久久精品精品6精品精品 | 高清乱码一卡二卡视频| 高清成年美女xx网站黄| 宝贝打开点我要尿里面h | 成人福利午夜无码专区| 91在线一区二区三观看| 成人免费乱码大片A毛片| 超清乱人伦中文视频| 最新亚洲人成无码网WWW电影| 3d肉蒲团电影下载| 成人片毛片AAA片免费| 成在人线av无码免观看麻豆| 69精品丰满人妻无码视频A片 | 超碰97在线线播放 | av在线天堂网站中文字幕| 18禁无遮挡羞羞污污污污免费| 国产吧在线观看视频论坛 | 大帝a∨无码视频在线播放 | 69精品国产高清一区二区三区| 成版人one一个app| 97精品国产一区| 成年美女少妇看黄片 | 成人天堂入口网站| 俄罗斯老熟女又乱又伦 | 国产av一区二区rhg| 大香蕉在线综合在线观看| 176精品二区免费视频| 成3d漫二区三区四区| 96533电视影片免费 | 欧美日本一区二区三四区| 国99精品无码一区二区三区| 91在线无码精品| 最近最新中文字幕在线视频| 成年美女网站色在线看免费| 高清乱码一卡二卡视频| 成人嘿咻色情一区二区| 1024手机在线看片日本欧美 | 99资源在线视频一区二区 | av天堂热无码手机版| 粗大禁伦亲女H顾林晓晓| 最近最新中文字幕在线视频| 最近国语高清免费观看视频| 99热这里只有精品8 | 不卡的神马电影网| 打扑克牌又疼又叫视频软件| 综合在线日韩欧美 | 91在线无码精品| 床震奶头好大揉着好爽视频| 国产成年无码AU在线观看 | h视频尤物在线一区| 成年美女黄网站18禁动态图片| 成全免费观看在线播放| avast免费版| 69caocom| 国产超薄丝袜在线观看| 94久久精品午夜| 99视频内射三四 | 最新国产日韩在线观看网站| 超级碰碰成人免费视频app| 超级碰碰成人免费视频app| 17c国产精品88888| 成人瑟瑟在线观看| 成人18在线视频| 18禁午夜免费福利久久| 国产精品一区二区无码免费看片| 国偷自产aV一区二区三区| 东京热无码AV男人的天堂| 丁香花免费高清视频完整版| 成人大片视频免费在线观看| 国产成人a一片免费看| 91国产偷拍自拍| av综合网男人的天堂| 高清毛片无遮挡免费视频| 高清完整版在线观看| 91欧美日韩在线一区二区| 俺去也新网影音先锋| 第九色区AV天堂| 日本A一片中国A一片| 宝贝打开点我要尿里面h | 爱爱网网站免费观看| 成人深夜免费在线视频| 福利视频导航在线| av在线不卡网站无码18禁| 最近国语高清免费观看视频| 最新一区二区三区在线影院| gogogo免费高清看中国国语| 最新国产三级电影在线播放| 抱起来内射丰满少妇视频| 中文人妻熟妇乱又伦精品| 成年人在线观看视频| 91视频黄色免费| av免费在线观看香蕉 | 明明在线观看一区二区三区| 国产ts上海在线观看| 亚洲无码一区二区av| 成人大片视频免费在线观看| www.99热这里只有精品 | 高清完整版在线观看| 91精品国产麻豆福利在线| 最近更新中文字幕7| 91香蕉视频最新版| 91精品国产高清久久久电影| 99日韩精品视频| 给我免费看播放片| 大香蕉在线综合在线观看| 国产吧在线观看视频论坛 | 91人澡人妻人人做人人爽 | 成人A级情欲片在线观看免费HD| japanese17一19hd| 高清国产在线看片| 99视频内射三四 | japanese17一19hd| 成年人在线观看视频| A一区二区三区乱码在线 | 2019中文字幕V片在线 | 成人三级免费视频| 精品成人无码一区二区久| 最近免费的中文字幕一| 超碰97在线人人在线| 97无码免费人妻超级碰碰碰| 打扑克牌又疼又叫视频软件| 成人黄片av在线免费观看| av无码在线播放| 18勿入太黄45分钟在线| 电影人妻秘书久久精品观看| 第九理论午夜电影院| 99国产成人精品av电影| 成人自拍网站在线观看| wwwav78tv | 99蜜桃臀久久久欧美精品制服丝袜亚洲中文综合 | 在线观看av永久免费| 60熟妇人妻精品中文字幕| 97国产v欧美 | 99无码精品热在线观看| 国产成人精品18禁| 9191国语精品高清在线最新| www.日本视频在线观看| 91精品啪在线观看国产18 | 欧美mv日韩mv国产网站app| 91视频黄色免费| 国产aⅴ精品动漫一区二区| 91欧美日韩在线一区二区| 不带套绝色中出中文无码| 18禁黄网站无码无遮挡| 高清乱码一卡二卡视频| 宝贝~好爽~好硬~好紧~视频| heyzo色综合中文字幕无码| 3P人妻少妇对白精彩视频 | 成全免费观看在线播放| 4色视频中文字幕| 成年人免费看二区三区视频 | 99久久夜色精品国产| 国产成人精品A视频免费福利| 51精品久久亚洲中文无码| 高清欧美日韩中文字幕 | 东京不热视频在线播放| 成人片毛片AAA片免费| 91大神精品伊人| 东北寡妇特级毛片免费| 2024丁香五月天之婷婷综合缴情| 高清亚洲精品一区二区三区| 超清乱人伦中文视频| 成年美女网站色在线看免费| 波多野结衣一本加勒比69| 伴郎粗大的内捧猛烈进出视频观看| av在线天堂网站中文字幕| 国产激情久久99久久| 成人精品久久国产av| 多毛的大隂户撒尿特写| 97精品人人抽插| 91精品啪在线观看国产18 | 抱起来内射丰满少妇视频| 97人妻成人免费视频| 国产又爽又黄游戏视频| 苍井空电影种子下载| 18禁午夜免费福利久久| 俺去也影音先锋播放| 99视频内射三四 | 国产办公室老板AV秘书| 波多野结衣亚洲中文字幕| 成人精品午夜久久| 高清完整版在线观看| 国偷自产aV一区二区三区| A一区二区三区乱码在线 | 5566成人精品视频免费| 变态另类欧美天堂网 | 俄罗斯老熟女又乱又伦 | 亚洲中文字幕无码一区红杏av| 91国产偷拍自拍| 成人午夜特黄AA片男| 国产v a手机免费观看| 综合在线日韩欧美 | 在线播放中文无码AV有码| 丁香婷婷五月情天| 扒开女人内裤猛进猛出免费视频 | 成人免费无码大片a毛片| 91av欧美一区二区 | 国产av巨作一区二区三区| 成人黄色免费在线播放| www天堂资源在线| 床震奶头好大揉着好爽视频| av在线不卡网站无码18禁| 伴郎粗大的内捧猛烈进出视频观看|